Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Einfluß der Proteinkinase G-Typ I auf die muscarinerg- und Stickstoffmonoxid-vermittelte Hemmung des L-Typ-Calciumkanals in Kardiomyozyten transgener, Proteinkinase G-Typ I-überexprimierender Mäuse

Bastein, Michaela

In mammalian myocardium the calcium influx through cardiac L-type calcium channel has a determinant role for sensitive coupling of excitation and contraction of the myofilaments. The L-type calcium channel is regulated by different second messengers and signal cascades. One of these second messengers is the protein kinase G-type I, which has already been identified by MERY et al. (1991), JIANG et al. (2000) and KLEIN et al. (2000) as a mediator of cGMP-mediated reduction of the enhanced b -adrenergic L-type calcium current. Aim of this study was to investigate a possible participation of the protein kinase G-type I (PRKGI) on the nitric oxide- and muscarinic- mediated inhibition of the L-type calcium channel in cardiomyocytes. For that purpose a transgenic mice with cardiac overexpression of the protein kinase G-type I was generated. Single channel measurements of the L-type calcium channel were recorded in the Cell-attached configuration of the Patch-Clamp technique on isolated cardiomyocytes of adult non-transgenic (+/+) and transgenic (Tg/+) siblings. Non-stimulated protein kinase G-type I had no measurable effect on basal activity of the L-type calcium channel in both groups. To prove a possible influence of protein kinase G-type I on the nitric oxide-mediated channel regulation the nitric oxide donor DEA/NO was added to the cardiomyocytes. DEA/NO caused a non-significant decrease of channel activity in the non-transgenic group but a significant reduction in the transgenic group. The inhibitory effect of DEA/NO was stronger after b -adrenergic prestimulation of the cardiomyocytes. The results indicate a participation of protein kinase G-type I (PRKG1) on the nitric oxide-mediated regulation of the L-type calcium channel. Furthermore the collected data support a distinct influence of the NO/GC/cGMP/protein kinase G-type I-signaling pathway on calcium influx in case of enhanced sympathetic activity. To investigate the mechanism of muscarinic signaling further series of tests were done. Therefore the muscarinic receptor agonist carbachol was applied to the cardiomyocytes. Carbachol per se had no detectable effect in both groups. After previous b -adrenergic stimulation, carbachol induced a similar inhibition of the calcium current in non-transgenic as well as in transgenic mice. Simultaneous delivery of carbachol and the cGMP-analogue 8-Br-cGMP produced an additional inhibitory effect on L-type calcium channel activity in the transgenic group. Cell-incubation with pertussistoxin prevented a carbachol-mediated effect in both groups. Thus, a participation of protein kinase G-type I on muscarinic receptor stimulation results in a Gi-protein mediated inactivation of the adenylyl cyclase.

Im Myokard von Säugetieren ist der Calciumeinstrom durch den kardialen L-Typ-Calciumkanal von entscheidender Bedeutung für eine fein abgestimmte Kopplung von Exzitation und Kontraktion der Myofilamente. Der L-Typ-Calciumkanal wird durch verschiedene Botenstoffe und Signalkaskaden reguliert. Ein Botenstoff ist die Proteinkinase G-Typ I, die von MERY et al. (1991), JIANG et al. (2000) und KLEIN et al. (2000) als Mediator einer cGMP-vermittelten Reduktion des b -adrenerg gesteigerten L-Typ-Calciumstromes identifiziert wurde. Das Ziel dieser Arbeit war, eine mögliche Beteiligung der Proteinkinase G-Typ I (PRKG1) an der Stickstoffmonoxid- und muscarinerg-vermittelten Hemmung des L-Typ-Calciumkanals im Kardiomyozyten zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde als Versuchsmodell eine transgene Maus generiert, die herzmuskelspezifisch die Proteinkinase G-Typ I überexprimiert. An isolierten Kardiomyozyten adulter nicht-transgener (+/+) und transgener (Tg/+) Geschwistertiere wurden in der Cell-attached-Konfiguration der Patch-Clamp-Technik vergleichend Einzelkanalmessungen des L-Typ-Calciumkanals vorgenommmen. Die nicht-stimulierte Proteinkinase G-Typ I veränderte die Basalaktivität des L-Typ-Calciumkanals in beiden Versuchsgruppen nicht. Um einen möglichen Einfluß der Proteinkinase G-Typ I auf die Stickstoffmonoxid-mediierte Regulation des Kanals nachzuweisen, wurde den Kardiomyozyten der Stickstoffmonoxid-Donator DEA/NO zugefügt. DEA/NO bewirkte einen nicht-signifikanten Abfall der Kanalaktivität in der nicht-transgenen Versuchsgruppe und eine signifikante Reduktion in der transgenen Versuchsgruppe. Der hemmende Effekt von DEA/NO fiel nach vorheriger b -adrenerger Prästimulation der Kardiomyozyten stärker aus. Die Ergebnisse lassen auf eine Beteiligung der Proteinkinase G-Typ I (PRKG1) an der Stickstoffmonoxid-vermittelten Regulation des L-Typ-Calciumkanals schließen. Darüber hinaus belegen die erhobenen Daten einen deutlichen Einfluß des NO/GC/cGMP/Proteinkinase G-Typ I-Signalweges auf den Calciumeinstrom bei gesteigerter Sympathikusaktivität. Um eine eventuelle Beteiligung der Proteinkinase G-Typ I an der muscarinerg-vermittelten L-Typ-Calciumkanalregulation zu untersuchen, wurde den Kardiomyozyten das Parasympathomimetikum Carbachol appliziert. Die Gabe von Carbachol hatte per se in beiden Versuchsgruppen keine Wirkung. Nach vorheriger b -adrenerger Stimulation führte Carbachol sowohl bei den nicht-transgenen, als auch bei den transgenen Mäusen zu einer gleich starken Hemmung des Calciumstromes. Die gleichzeitige Gabe von Carbachol und dem cGMP-Analogon 8-Br-cGMP bewirkte in der transgenen Gruppe einen zusätzlich hemmenden Effekt auf die Aktivität des L-Typ-Calciumkanals. Die Inkubation der Zellen mit Pertussistoxin verhinderte in beiden Gruppen einen Carbachol-vermittelten Effekt. Eine Beteiligung der Proteinkinase G-Typ I an der muscarinergen Regulation des L-Typ-Calciumkanals in Kardiomyozyten kann somit ausgeschlossen werden. Die muscarinerge Signalantwort verläuft vielmehr durch eine Gi-Protein-vermittelte Inaktivierung der Adenylatcyclase.

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Bastein, Michaela: Einfluß der Proteinkinase G-Typ I auf die muscarinerg- und Stickstoffmonoxid-vermittelte Hemmung des L-Typ-Calciumkanals in Kardiomyozyten transgener, Proteinkinase G-Typ I-überexprimierender Mäuse. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

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