Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Etablierung eines fluoreszenzmikroskopischen Spermienchromatinstruktur Assays im Rahmen der spermatologischen Diagnostik beim Hund

Biege, Jasmin-Janina

The aim of the study was to establish the modified fluorescence microscopical sperm chromatin structure assay (mfSCSA) for dog spermatozoa investigating methodical influences on the mfSCSA and relations between the sperm chromatin structure and selected semen parameters.   Ejaculates of a total of 42 dogs of different breeds aged between one year and nine years were included. The semen profile was composed of ejaculate volume, sperm density, total number of spermatozoa, microscopically estimated and computer analysed sperm motility and velocity, the proportion of spermatozoa with damaged plasma membrane stained by eosin and propidium iodide and the total percentage of morphologically abnormal spermatozoa. The mfSCSA was performed using native, thawed shock frozen or cryopreserved semen depending on the aspect examined. The investigations by mfSCSA included the repeatability of the results, the influences of different sperm concentrations (50, 100, 300 and 600 Mio.) and room temperatures (22 and 26-27°C), a 2h exposition of the semen to different room temperatures (18 and 20-21°C) and light conditions (light protected and not light protected, covered and not covered) as well as of storing native sperm and native sperm smears for three days at 5°C on the sperm chromatin structure. Further more the effects of storing Acridin Orange stained sperm smears under light protection at 5°C for four weeks, of semen shock freezing and cryopreservation (-196°C) on the sperm chromatin structure as well as the intraindividual variability of the sperm chromatin structure in different ejaculates were investigated. The mfSCSA-values (SCSAT = computer assisted analysis, SCSAC = corrected computer assisted analysis) were correlated with normospermia and dysspermia, with the proportion of progressively motile spermatozoa, the Velocity Straight Line, the Velocity Averaged Path, the Velocity Curve Line, the proportion of spermatozoa with damaged plasma membrane stained with propidium iodide (PI) and the total percentage of morphologically abnormal spermatozoa as well as the proportion of spermatozoa with abnormal heads ≤ 5 % and > 5 %.   The following results were obtained:   -         The low standard deviations between the values of repeated analyses of the sperm chromatin structure in cryopreserved sperm samples of different dogs (at five different days of investigation: 0.7 % for SCSAT, 0.6 % for SCSAC; two smears per day and ejaculate: 1.6 % for SCSAT, 1.4 % for SCSAC) characterize the mfSCSA as test with a high repeatability of the results. -         The sperm concentration had no influence on the mfSCSA-values. -         Performance of the assay at room temperatures of 22 and 26-27°C showed a clear increase of the proportion of chromatin-instable cells at 26-27°C in semen of three of five dogs.  -         Exposing native semen for 2h to different room temperatures (18 and 20-21°C) and light-conditions (light protected and not light protected, covered and not covered) had no influence on the sperm chromatin structure. -         The stability of the sperm chromatin was significantly decreased after storing native semen at 5°C for 48h (p ≤ 0.05). -         Storage of native sperm smears at 5°C for 24 and 48h resulted in a marked increase of the proportion of chromatin-instable cells. -         The evaluation of the sperm chromatin structure in stained sperm smears is possible up to four weeks after staining if the stained smears are stored light protected at 5°C. This shows the high stability of the fluorescent stain Acridine Orange. -         In native semen significantly more chromatin-instable cells were found than in thawed shock frozen and cryopreserved semen (-196°C) (p ≤ 0.05). -         Standard deviations of 3.9 % (SCSAT) and 2.9 % (SCSAC) indicate a marked  intraindividual variability of the percentage of chromatin-instable cells. -         The proportions of chromatin-instable cells evaluated by SCSAT and SCSAC show a significantly linear correlation (p < 0.001). -         The average proportion of chromatin-instable cells of ejaculates with normospermia was 4.2±3.5 % (SCSAT) and 4.1±5.8 % (SCSAC), with dysspermia 15.7±24.3 % (SCSAT) and 14.0±23.7 % (SCSAC). This difference was not significant. -         The proportion of chromatin-instable cells was significantly correlated (p ≤ 0.05) with the proportion of progressively motile spermatozoa, the Velocity Averaged Path and the Velocity Curve Line determined by computer analysis, the proportion of spermatozoa  with damaged plasma membrane stained by propidium iodide as well as the total percentage of morphologically abnormal spermatozoa. -         In ejaculates with ≤ 5 % morphologically abnormal sperm heads the average SCSAT-value was 7.9±14.0 % and the average SCSAC-value was 7.7±14.4 %. In ejaculates with > 5 % morphologically abnormal sperm heads the mfSCSA-values (SCSAT: 25.0±30.6 %; SCSAC: 24.3±30.8 %) were significantly higher (p ≤ 0.05).   The mfSCSA is characterized by a high repeatability of the results in analysing the stability of canine sperm chromatin against acid denaturation in situ. For establishing the mfSCSA as a supplementary parameter in the fertility diagnosis of male dogs continuing investigations with regard to connections between the sperm chromatin structure and the fertility potential as well as representative normal ranges are necessary.

Ziel der Studie war es, den modifizierten fluoreszenzmikroskopischen Spermienchromatinstruktur Assay (mfSCSA) für Hundesperma zu etablieren, indem methodische Einflüsse auf den mfSCSA und Beziehungen zwischen der Spermienchromatinstruktur und ausgewählten spermatologischen Parametern untersucht werden sollten.   In die Untersuchungen wurden Ejakulate von insgesamt 42 Rüden unterschiedlicher Rassen im Alter von einem Jahr bis neun Jahren einbezogen. In die Samenuntersuchung gingen das Ejakulatvolumen, die Samendichte, die Spermiengesamtzahl, die mikroskopisch geschätzte und computergestützt ermittelte Spermienmotilität und -geschwindigkeit, der Anteil membrangeschädigter Spermien nach Eosin- und Propidiumiodidfärbung und der Gesamtanteil morphologisch abweichender Spermien ein. Das Sperma wurde je nach Fragestellung in nativer, aufgetauter schockgefrorener und / oder tiefgefrorener Form dem mfSCSA zugeführt. Die Untersuchungen mittels mfSCSA schlossen die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse, die Einflüsse verschiedener Spermienkonzentrationen (50, 100, 300 und 600 Mio.), unterschiedlicher Raumtemperaturen (22 und 26-27°C), einer zweistündigen Exposition des Samens gegenüber verschiedenen Raumtemperatur- (18 und 20-21°C) und Lichtverhältnissen (lichtgeschützt und nicht lichtgeschützt, abgedeckt und nicht abgedeckt) sowie einer dreitägigen Lagerung von Nativsperma und Nativspermaausstrichen bei 5°C auf die Spermienchromatinstruktur ein. Ferner wurden die Auswirkungen einer vierwöchigen Lagerung Akridin Orange gefärbter Ausstriche bei 5°C unter UV-Lichtausschluss auf die Auswertbarkeit und der Einfluss der Schock- und Tiefgefrierung (-196°C) des Spermas auf die Spermienchromatinstruktur sowie die intraindividuelle Variabilität des Spermienchromatins in mehreren Ejakulaten untersucht. Die mfSCSA-Werte (SCSAT = ausschließliche Computeranalyse, SCSAK = Computeranalyse, korrigiert) wurden mit Ejakulaten mit Normospermie und Dysspermie, dem Anteil vorwärtsmotiler Spermien, der Velocity Straight Line, der Velocity Averaged Path, der Velocity Curve Line, dem Anteil membrangeschädigter Spermien nach Propidiumiodidfärbung und dem Gesamtanteil morphologisch ab- weichender Spermien sowie mit dem Anteil an Veränderungen des Spermienkopfes korreliert.   Folgende Ergebnisse wurden erarbeitet:   -         Die geringen Standardabweichungen zwischen den Werten wiederholter Analysen der Spermienchromatinstruktur in Tiefgefrierspermaproben verschiedener Rüden (an fünf verschiedenen Untersuchungstagen: 0,7 % für SCSAT, 0,6 % für SCSAK; zwei Ausstriche pro Untersuchungstag und Ejakulat: 1,6 % für SCSAT, 1,4 % für SCSAK) kennzeichnen den mfSCSA als Testverfahren mit hoher Reproduzierbarkeit der Ergebnisse.  -         Die Spermienkonzentration der Proben hatte keinen Einfluss auf die mfSCSA-Werte. -         Die Testdurchführung bei Raumtemperaturen von 22 und 26-27°C zeigte im Samen von drei der fünf Rüden einen deutlichen Anstieg des Anteils chromatininstabiler Spermien bei 26-27°C. -         Die zweistündige Exposition des Samens gegenüber verschiedenen Raumtemperatur- und Lichtverhältnissen hatte keinen Einfluss auf das Spermienchromatin. -         Die Spermienchromatinstabilität im Nativsperma war nach 48-stündiger Lagerung bei 5°C signifikant herabgesetzt (p ≤ 0,05). -         Die 24- und 48-stündige Lagerung von Nativspermaausstrichen bei 5°C führte zu  einer deutlichen Zunahme der Chromatininstabilität. -         Die Auswertbarkeit der Spermienchromatinstruktur in gefärbten, bei 5°C unter UV-Lichtausschluss aufbewahrten Spermaausstrichen war bis zu vier Wochen gegeben, was auf eine entsprechende Stabilität des Fluoreszenzfarbstoffes Akridin Orange hinweist. -         In Nativsperma wurden signifikant mehr chromatininstabile Spermien ermittelt als in aufgetautem schockgefrorenem und tiefgefrorenem Sperma (-196°C) (p ≤ 0,05). -         Die intraindividuelle Variabilität des Prozentsatzes chromatininstabiler Spermien ist mit Standardabweichungen von 3,9 % (SCSAT) und 2,9 % (SCSAK) relativ groß. -         Die mittels SCSAT und SCSAK ermittelten Anteile chromatininstabiler Spermien sind hochsignifikant linear korreliert (p < 0,001). -         Der mittlere Anteil chromatininstabiler Spermien betrug bei Normospermie  4,2±3,5 % (SCSAT) bzw. 4,1±5,8 % (SCSAK), bei Dysspermie 15,7±24,3 % (SCSAT) bzw. 14,0±23,7 % (SCSAK). Dieser Unterschied war nicht signifikant. -         Es ergaben sich signifikante Korrelationen (p ≤ 0,05) zwischen dem Anteil chromatininstabiler Spermien und dem durch Computeranalyse ermittelten Anteil vorwärtsmotiler Spermien, der Velocity Averaged Path und der Velocity Curve Line, dem Anteil membrangeschädigter Spermien nach Propidiumiodidfärbung  sowie dem Gesamtanteil morphologisch abweichender Spermien. -         In Ejakulaten mit ≤ 5 % Veränderungen des Spermienkopfes betrug der mittlere SCSAT-Wert 7,9±14,0 % und der mittlere SCSAK-Wert 7,7±14,4 %. In Ejakulaten mit > 5 % Veränderungen des Spermienkopfes wurden mit 25,0±30,6 % und 24,3±30,8 % signifikant höhere mittlere SCSAT- und SCSAK-Werte nachgewiesen (p ≤ 0,05).   Der mfSCSA zeichnet sich als Test mit hoher Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zur Analyse der Stabilität des Chromatins caniner Spermien gegenüber Säuredenaturierung in situ aus. Zur Etablierung des mfSCSA als ergänzenden Parameter in der Fertilitätsdiagnostik beim männlichen Hund sind weiterführende Untersuchungen auf Zusammenhänge zwischen der Spermienchromatinstruktur und dem Fertiltätspotential sowie auf repräsentative Normbereiche notwendig.

Vorschau

Zitieren

Zitierform:

Biege, Jasmin-Janina: Etablierung eines fluoreszenzmikroskopischen Spermienchromatinstruktur Assays im Rahmen der spermatologischen Diagnostik beim Hund. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

Rechte

Nutzung und Vervielfältigung:
Alle Rechte vorbehalten

Export