Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Etablierung eines In-vivo-Modells zur Charakterisierung der Immunreaktion des Uterus von Jungsauen nach Insemination

Döhring, Anke

Insemination induces an inflammatory reaction causing immigration of leukocytes into the lumen and tissue of the uterus. These immigrated cells are mostly neutrophils, though other cells from the non-adaptive and adaptive immune response are also present. The aim of the study was to establish an animal model that would characterise the local uterine immune response after insemination in estrous gilts.   Under general anaesthesia, the uterus was exposed through mid-ventral laparotomy. Ligation of both uterine horns approx. 25 cm distal of the uterotubal junction was followed by transmural application of 20 ml of fresh boar semen cranial of the ligature in one uterine horn. As control, the contralateral horn was infused with the same amount of sterile saline. Uterine lymphatic vessels were made visible by injecting Evan’s blue under the serosa. Close to the Lnn. uterini, which were present on both sides in 7 of 10 gilts, a prominent lymphatic vessel was bluntly dissected and ligated distal of the dissected part. After cutting the vessel with iris scissors, a polyethylene tube was inserted into the vessel and the spontaneously-flowing lymph was collected in an EDTA vial. The sampling started 60 min after uterine infusion and lasted for 45 min. Every 15 min the vial was changed. After finishing the lymph sampling, blood samples of the uterine vein, the ovarian artery and the ear vein were collected. Also the Lnn. uterini and tissue samples of the uterus and the uterine side of uterotubal junction were removed.   From the lymph samples, total and nucleated cell numbers were counted with a haemocytometer. Using flowcytometry, the lymph nodes were analysed for reactivity with monoclonal antibodies against CD4, CD8, CD18 MHCII-DR and MHCII-DQ markers. The same antibodies were used for the blood samples. The tissue samples were snap-frozen in liquid nitrogen or fixed in formaldehyde and embedded in paraffin.  For immunohistochemical analysis, cryostat sections were prepared and examined for occurrence and distribution of MHCII- and CD4-expressing cells. For analysis of mast cell distribution and occurrence, paraffin sections were prepared. Immunohistochemical analysis of mast cell tryptase and metachromatical staining with toluidin blue were done.   The percentage of non-nucleated cells in the lymphatic fluid decreased as the collection period lengthened, but contained erythrocytes in all cases, indicating the ingress of blood into the lymph collection vial. For this reason, a differentiation of leukocytes was not performed. For the Lnn. uterini, 3 of 4 gilts showed lower values for CD4 and 3 of 6 gilts higher values for MHCII markers on the semen side than on the control side. For the blood samples, significantly higher values for CD8 high were measured in the ear vein than in the ovarian artery after semen treatment. After saline treatment significantly higher values for CD4 were found in the uterine vein than in the ear vein. Immunohistochemical analysis of uterine tissue samples for MHCII positive cells resulted in significantly higher values for the semen treated uterus horn than the control horn. After semen infusion significantly higher values for MHCII expressing cells in the uterotubal junction than in the uterus were found. There were no significant differences for CD4 positive cells.   In conclusion, an animal model was established to study the local immune response of uterine tissue and associated lymph nodes. However, it was impossible to obtain lymph without signs of blood contamination appearing within a short-term sampling period. The significant difference between the treated and the control side for MHCII positive cells in the uterine tissue indicates a role of antigen presenting cells in the post insemination immune response. The significant differences between the semen-treated uterus and the uterotubal junction suggest a specific function of the uterotubal junction in this context.

Insemination führt zu einer Entzündungsreaktion mit Immigration von Leukozyten in das Lumen und Gewebe des Uterus. Bei den immigrierenden Zellen handelt es sich vor allem um neutrophile Granulozyten, aber auch um andere Zellen der adaptiven und nicht adaptiven Immunantwort. Ein Tiermodell sollte entwickelt werde, das eine Charakterisierung der lokalen Immunantwort des Uterus nach Insemination bei Jungsauen im Östrus erlaubt.   Bei anästhesierten Jungsauen wurde der Uterus nach einem Medianschnitt in der Linea alba vorgelagert. Etwa 25 cm distal der uterotubalen Verbindung wurde eine Ligatur angelegt. Im ligierten  Bereich wurden transmural in ein Uterushorn 20 ml frisch gewonnener Ebersamen appliziert, in das contralaterale Horn erfolgte die Applikation von 20 ml steriler physiologischer Kochsalzlösung als Kontrolle. Uterine Lymphgefäße wurden durch subseröse Injektion von Evans Blue dargestellt. Nahe der Lnn. uterini wurde ein prominentes Lymphgefäß stumpf freipräpariert und distal des präparierten Bereichs ligiert. Das Lymphgefäß wurde mit einer Irisschere eingeschnitten und ein Polyethylenschlauch eingeführt. Die spontan fließende Lymphe wurde in einem EDTA- Röhrchen aufgefangen. Die Lymphgewinnung begann 60 min nach Applikation von Kochsalzlösung bzw. Samen und dauerte 45 min. Alle 15 min wurde das Auffanggefäß gewechselt. Nach Beenden der Lymphgewinnung wurden zum einen Blutproben aus Uterusvene, Ovararterie und Ohrvene gewonnen. Zum anderen wurden die uterinen Lymphknoten entfernt und Gewebeproben aus Uterus und uterinem Teil der uterotubalen Verbindung gewonnen. Nach Bestimmung des Volumens wurde die Lymphe mittels einer Zählkammer nach Thoma auf die Gesamtzahl von Zellen sowie die Anzahl kernhaltiger Zellen untersucht. Die Lymphknoten wurden homogenisiert und mittels Flowzytometrie wurde die Reaktivität mit monoklonalen Antikörpern gegen CD4, CD8, CD18, MHCII-DR und MHCII-DQ bestimmt. Diese Antikörper wurden auch bei der flowzytometrischen Analyse der Blutproben verwendet. Die Gewebeproben wurden schockgefroren oder nach Fixierung in Formalin in Paraffin eingebettet. Der immunhistochemische Nachweis von MHCII und CD4 Oberflächenantigenen erfolgte an Kryostatschnitten. Mastzellen wurden mittels metachromatischer Toluidinblaufärbung und immunhistochemischem Tryptasenacheis an Paraffinschnitte dargestellt.   Der Anteil kernloser Zellen in der Lymphe verringerte sich mit zunehmender Sammeldauer. In allen Lymphproben waren jedoch Anteile an Erythrozyten nachweisbar, was eine Blutkontamination vermuten ließ. Da nicht geklärt werden konnte, ob die Leukozyten in den Lymphproben aus Blut oder Lymphe stammten, wurde keine Differenzierung der Leukozytenpopulation durchgeführt. Die durchflusszytometrische Untersuchung der Lymphknoten ergab keine signifikanten Unterschiede zwischen der inseminierten Seite und der Kontrollseite. Allerdings zeigte die Auswertung für drei von sechs Tieren höhere Werte für MHCII-DR sowie für drei von vier Tieren niedrigere Werte für CD4 in den Lymphknoten des mit Samen behandelten Uterushorns. In den Blutproben aus der Ohrvene konnten nach Behandlung mit Samen signifikant höhere Werte für CD8 high gemessen werden als in denen der Ovararterie. Für CD4 konnten nach Kochsalzbehandlung signifikant höhere Werte in den Proben aus der Uterusvene als in denen aus der Ohrvene gemessen werden. Zwischen den Behandlungen mit Samen und Kochsalzlösung gab es keine signifikanten Unterschiede. Die immunhistochemische Untersuchung ergab signifikant höhere Werte für MHCII positive Zellen nach intrauteriner Applikation von Samen im Vergleich zu Kochsalzlösung. In den Gewebeproben der uterotubalen Verbindung waren nach Samenapplikation signifikant mehr MHCII positive Zellen als in denen des Uterus nachweisbar. Der immunhistochemische CD4 Nachweis ergab keine signifikanten Unterschiede.   Ein Tiermodell zur Untersuchung lokaler Immunreaktionen des Endometriums, der uterinen Lymphknoten und des lokalen Blutgefäßsystems nach Insemination bei der Jungsau wurde entwickelt. Lymphe konnte innerhalb der relativ kurzen Sammeldauer nur mit Anteilen an Erythrozyten ungeklärter Herkunft gewonnen werden. Die Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchungen weisen auf eine Rolle antigenpräsentierender Zellen bei der uterinen Immunantwort auf Insemination hin. Die uterotubale Verbindung könnte in diesem Zusammenhang eine spezifische Funktion haben.

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Döhring, Anke: Etablierung eines In-vivo-Modells zur Charakterisierung der Immunreaktion des Uterus von Jungsauen nach Insemination. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

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