Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Analysis of new variants in the bovine and ovine PRNP

Eckert, Julia

 It is of great interest to clarify the role of the PRNP plays in TSE pathogenesis. Especially for sheep, an association of ovine PRNP variants with scrapie susceptibility has been attested, and variants at three ORF positions are proposed to show the highest effect. However, they do not explain all the observed variability, and it is necessary to identify additional markers in the PRNP in order to fine map the effects. The bovine PRNP is still being analysed for similar associations. By creating a dense set of readily accessible markers in the PRNP region, future association studies, as well as genotyping and breeding for TSE resistance will be facilitated. GELDERMANN et al. (2003) identified microsatellite sites in the bovine and ovine PRNP region on hand of software assisted screening of published sequences. In the present study these sites were amplified, cloned, sequenced and analysed.   Eight polymorphic bovine microsatellite sites and four polymorphic ovine microsatellite sites for which sequence information was available at the Genbank database were subjected to analysis. In addition seven other ovine sites upstream of the Genbank database sequence were amplified using primers defined for bovine PRNP sites, three of which displayed polymorphisms after fragment length analysis on the A.L.F. sequencer. PCR was performed for individuals of eight cattle breeds and eleven sheep breeds to identify as many polymorphisms as possible. Two to eight different samples were cloned for the bovine sites and led to the identification of altogether 28 different sequences. For the eleven ovine sites one to seven samples per site were cloned and also led to the identification of 28 different sequences. All sequences gained for bovine polymorphic PRNP microsatellite loci could be attributed to the respective PRNP sequences. In sheep for four of the six polymorphic microsatellite sites all variants were attributed to the respective published sequences as well, while the origin of some variants found for sites S05 and S09 could not be identified. Though repeat variation of the microsatellite motif was the main cause of length polymorphisms, insertions and deletions were involved at eight sites. At seven of the polymorphic sites SNPs were also found and in one bovine and one ovine site alleles were identified that differed in sequences, but showed the same fragment length.   The results of this study show the merit of software assisted screening of DNA sequences for the identification of polymorphic microsatellite sites. Through the application of heterologous primers it was also possible to access previously unsequenced areas of the ovine PRNP region. The sequence origin and the nature of the polymorphisms was successfully analysed by cloning and sequencing, and most sites can now be used for the fine mapping of the bovine and ovine PRNP region in genotyping studies.

Es ist von großem Interesse die Rolle des PRNP in der TSE-Pathogenese zu klären. Beim Schaf wurde bereits eine Assoziation oviner PRNP-Varianten mit Scrapieanfälligkeit nachgewiesen, wobei den Varianten dreier ORF-Positionen ein besonders großer Einfluss zugeschrieben wird. Dennoch können sie nicht die gesamte Variabilität erklären und es ergibt sich die Notwendigkeit zusätzliche Marker im PRNP zu identifizieren um eine Feinkartierung vornehmen zu können. Das bovinen PRNP wird noch immer auf ähnliche Assoziationen untersucht. Die Schaffung eines dichten, leicht zugänglichen Markersets in der PRNP-Region kann zukünftige Assoziationsstudien, sowie die Genotypisierung und die Zucht auf TSE-Resistenz erleichtern. GELDERMANN et al. (2003) konnten Mikrosatellitenpositionen in der PRNP-Region von Rind und Schaf durch Software-gestützte Analyse bereits veröffentlichter Sequenzen identifizieren. In der vorliegenden Arbeit wurden diese Positionen amplifiziert, kloniert, sequenziert und analysiert.   Acht polymorphe bovine und vier polymorphe ovine Mikrosatellitenpositionen, für die Datenbankeinträge in Genbank existierten, wurden in die Untersuchung einbezogen. Zusätzlich wurden sieben weitere ovine Positionen amplifiziert, die stromaufwärts der veröffentlichten Sequenz liegen, unter Verwendung von Primern, die für heterologe Positionen im Rindergenom definiert worden waren. Drei davon zeigten bei Fragmentlängenanalyse mittels eines A.L.F.-Sequenzierers ebenfalls Polymorphismen. DNA-Proben von Individuen aus acht Rinderrassen und elf Schafrassen wurden untersucht um möglichst viele Polymorphismen darstellen zu können. Zwei bis acht Proben wurden für jede bovine Position kloniert und 28 verschiedene Sequenzen identifiziert. Für die ovinen Positionen wurden zwischen einer und sieben Proben kloniert und ebenfalls 28 verschiedene Sequenzen dargestellt. Alle Sequenzen der bovinen PRNP-Mikrosatellitenpositionen konnten den entsprechenden veröffentlichen PRNP-Sequenzen zugeordnet werden. Beim Schaf konnten alle Sequenzen von vier polymorphen Positionen ebenfalls den Datenbankeinträgen zugeordnet werden. Die Herkunft einiger Varianten der ovinen Positionen S05 und S09 jedoch konnte nicht entgültig geklärt werden. Hauptursache der Fragmentlängenpolymorphismen waren Repeatvarianten des Mikrosatellitenmotivs. Bei acht Positionen spielten zusätzlich Insertionen und/oder Deletionen eine Rolle. Sieben der polymorphen Positionen enthielten außerdem SNPs. An je einer bovinen und einer ovinen Position traten Varianten auf, die anhand der Sequenzen, aber nicht anhand des Fragmentlängenpolymorphismus unterschieden werden konnten.   Die Ergebnisse dieser Arbeit belegen die Möglichkeit mit Hilfe Software-gestützter Sequenzanalyse polymorphe Mikrosatellitenpositionen zu identifizieren. Durch die Anwendung heterologer Primer konnten zuvor nicht sequenzierte Bereiche nahe des ovinen PRNP der Analyse zugänglich gemacht werden. Die Identität der dargestellten Sequenzen und das Wesen der Polymorphismen konnte mit der hier verwendeten Methode erfolgreich nachgewiesen werden. Der Großteil der untersuchten Positionen kann nun zur Feinkartierung von Geneffekten in den bovinen und ovinen PRNP-Bereichen zum Einsatz kommen.

Zitieren

Zitierform:

Eckert, Julia: Analysis of new variants in the bovine and ovine PRNP. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

Rechte

Nutzung und Vervielfältigung:
Alle Rechte vorbehalten

Export