Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Insulinabhängiger Glucosetransport in den Skelettmuskel von Ponys und Schweinen

Hacker, Anja

The aim of this study was to investigate possible cellular reasons for differences in insulin regulated glucose utilisation of pigs and ponies, which have been reported in euglycaemic, hyperinsulinaemic clamp-tests. In mammalians, glucose metabolism primarily takes place in skeletal muscles. Therefore, this tissue represents the main localisation for possible differences between those species concerning insulin regulated glucose metabolism. In order to clarify this question, an ex vivo in vitro method was established, which enabled the analysis of insulin induced glucose uptake as well as insulin stimulated GLUT-4-translocation in muscle cells. 5 g of Musculus semitendinosus were removed from male castrated Shetlandponies and female DL fattened pigs under anaesthesia in an open muscle biopsy. The samples were cut into slices and incubated with hyperglycaemic concentrations of glucose (10 mM) and without or with insulin in still physiological range (100 µIU/ml) as well as with supraphysiological concentrations (20000 µIU/ml). The measurement of glucose uptake was performed using 3-O-[3H]-Methylglucose (3-O-[3H]-MG) which is a glucose analogue that cannot be further metabolised. To investigate GLUT-4-translocation, crude membranes were isolated with differential centrifugation. Afterwards, plasma membrane and intracellular vesicles were separated in a continuous sucrose gradient. The amount of glucose transporters in both compartments was detected using SDS-PAGE and Western Blot with ECL. The additional investigation of GLUT in crude membranes served as an examination of a possible insulin induced biosynthesis of transporters. Furthermore, the amount of GLUT 1 in the membrane structures mentioned above was investigated to elucidate the role of GLUT 1 in glucose metabolism of pigs and ponies. Stimulation of muscle samples with 100 µIU/ml insulin led to a significant (p<0,05) increase in 3-O-[3H]-MG uptake of approx. 40% in ponies. Under maximal insulin concentration no further elevation was detectable. In contrast, pigs showed a significant (p<0,05) increase of 3-O-[3H]-MG transport of about 50% exclusively with 20000 µIU/ml insulin. Glucose uptake under maximal insulin stimulation was distinctly higher in pigs than in ponies. An incubation of samples with 100 µIU/ml insulin led to a significant (p<0,05) increase of the amount of GLUT 4 in the plasma membrane of ponies (approx. 8%), whereas 20000 µIU/ml insulin had no further effect. Ponies showed significantly (p<0,05) higher amounts of GLUT 4 in the plasma membrane than in intracellular vesicles with 100 and 20000 µIU/ml insulin. In pigs, the amount of GLUT 4 in the plasma membrane was significantly (p<0,05) higher in comparison to intracellular vesicles independent of the insulin concentration. Compared to basal, a significant (p<0,05) increase of the amount of GLUT 4 in the plasma membrane of about 26% was detectable exclusively with supraphysiological insulin concentration. Under these conditions the amount of GLUT 4 in the plasma membrane was significantly (p<0,05) higher in pigs than in ponies. In pigs, a significant (p<0,05) positive correlation was detectable between the amount of GLUT 4 in the plasma membrane and glucose transport rate. This could not be shown in ponies. In both species, incubation of the samples with different insulin concentrations had neither an effect on the GLUT 1 distribution between plasma membrane and intracellular vesicles nor on GLUT-1- or GLUT-4-biosynthesis. The results of these investigations show that in pigs as well as in ponies under hyperglycaemic conditions skeletal muscle glucose uptake relies at least partly on insulin stimulated translocation of GLUT 4 because the amount of GLUT 4 in the plasma membrane on the one hand and glucose uptake on the other hand were of similar course and correlated positively in pigs. Furthermore, the results of previous euglycaemic, hyperinsulinaemic clamp-tests were reproduced on cellular level. Under these conditions, M. semitendinosus proved to be less sensitive to insulin in ponies than in pigs. Also the ex vivo in vitro stimulation of muscle samples with supraphysiological insulin concentrations led to a distinctly weaker glucose uptake and a significantly (p<0,05) lower GLUT-4-translocation in ponies. Such a reduced insulin sensitivity of skeletal muscles of ponies could not be shown for physiological insulin concentrations.

Ziel dieser Studie war es, mögliche zelluläre Ursachen für die durch euglykämische, hyperinsulinämische Clamp-Tests nachgewiesenen Unterschiede hinsichtlich der insulinregulierten Glucoseutilisation zwischen Schweinen und Ponys zu ermitteln. Da im Säugetierorganismus die Glucoseumsetzung zum größten Teil in der Skelettmuskulatur erfolgt, bildet dieses Organsystem die Hauptlokalisation für etwaige tierartliche Unterschiede des insulinregulierten Glucosestoffwechsels. Um die genannte Fragestellung abzuklären, wurde eine ex vivo in vitro Methodik etabliert. Diese ermöglichte es, die insulininduzierte Glucoseaufnahme sowie die insulinstimulierte GLUT-4-Translokation in Myozyten zu analysieren. Männlichen kastrierten Shetlandponys und weiblichen DL-Mastschweinen wurden im Rahmen einer offenen Muskelbiopsie unter Vollnarkose ca. 5 g des M. semitendinosus entnommen. Hieraus wurden feine Muskelstreifen präpariert und mit Glucose in hyperglykämischer Konzentration (10 mM) sowie ohne und mit Insulin in noch physiologischer (100 µIU/ml) und supraphysiologischer Konzentration (20000 µIU/ml) inkubiert. Die Messung der myozytären Glucoseaufnahme erfolgte unter Verwendung des nicht verstoffwechselbaren Glucose-Analogons 3-O-[3H]-Methylglucose (3-O-[3H]-MG). Um die GLUT 4 Tanslokation zu erfassen, wurden zunächst die myozytären Gesamtmembranen mittels differentieller Zentrifugation gewonnen. Zur Isolierung des Sarkolemms und der zytoplasmatischen Vesikel erfolgte eine kontinuierliche Saccharosegradientenzentrifugation. Im Weiteren wurden die Glucosetransportergehalte beider Membrankompartimente durch SDS-PAGE und Western Blot mit ECL-Detektion ermittelt. Die zusätzliche Erfassung der GLUT in den Gesamtmembranen diente der Überprüfung einer eventuellen insulininduzierten Biosynthese der Transporter. Zudem wurden die GLUT 1 Gehalte in den Membranstrukturen ermittelt, um die Bedeutung dieses Transporters während der Glucoseumsetzung bei Schweinen und Ponys zu ermitteln. Die Stimulation der M. semitendinosus Präparate der Ponys mit 100 µIU/ml Insulin führte zu einem signifikanten (p<0,05) Anstieg der 3-O-[3H]-MG-Aufnahme um ca. 40%. Unter maximaler Insulinkonzentration war jedoch keine weitere Steigerung festzustellen. Beim Schwein hingegen nahm der 3-O-[3H]-MG-Transport ausschließlich mit 20000 µIU/ml Insulin signifikant (p<0,05) um ca. 50% zu. Damit war die myozytäre Aufnahme von 3-O-[3H]-MG unter maximaler Insulinstimulation beim Schwein deutlich höher als beim Pony. Die Inkubation der Muskelstreifen mit 100 µIU/ml Insulin führte beim Pony zu einem signifikanten (p<0,05), ca. 8%igen Anstieg der GLUT 4 Gehalte des Sarkolemms, während 20000 µIU/ml Insulin keine weitere Erhöhung dieses Parameters zur Folge hatten. Beim Pony wurden nach Stimulation mit 100 und 20000 µIU/ml Insulin signifikant (p<0,05) höhere GLUT 4 Gehalte in der Plasmamembran als in den zytoplasmatischen Vesikeln nachgewiesen. Beim Schwein hingegen lagen in allen Insulininkubationsstufen signifikant (p<0,05) höhere GLUT 4 Mengen im Sarkolemm als in den zytoplasmatischen Membranen vor. Allerdings kam es erst nach Inkubation der Muskelpräparate mit der supraphysiologischen Insulindosis zu einer signifikanten (p<0,05) Erhöhung der GLUT 4 Gehalte in der Plasmamembran um ca. 26%, verglichen mit basalen Verhältnissen. Unter diesen Bedingungen waren die GLUT 4 Gehalte im Sarkolemm der Schweine signifikant (p<0,05) höher als in demjenigen der Ponys. Beim Schwein bestand eine signifikante (p<0,05) positive Korrelation zwischen den GLUT 4 Gehalten der Plasmamembran und der Glucosetransportrate. Beim Pony konnte eine solche Beziehung nicht nachgewiesen werden. Die Inkubation der Muskelstreifen mit den verschiedenen Insulinkonzentrationen hatte bei beiden Spezies weder einen Effekt auf die GLUT 1 Verteilung zwischen dem Plasmalemm und den zytoplasmatischen Vesikeln noch auf die GLUT-1- und GLUT-4-Biosynthese. Die Resultate dieser Untersuchungen zeigen, dass sowohl beim Schwein als auch beim Pony die myozytäre Glucoseaufnahme unter hyperglykämischen Bedingungen zumindest teilweise auf einer insulinstimulierten Translokation des GLUT 4 beruht, da die GLUT 4 Gehalte der Plasmamembran einerseits und die Glucoseaufnahme andererseits in Abhängigkeit von der Insulinkonzentration gleichsinnig verliefen und im Falle des Schweines sogar signifikant positiv miteinander korrelierten. Zudem wurden die Ergebnisse vorangegangener euglykämischer, hyperinsulinämischer Clamp-Tests auf zellulärer Ebene reproduziert. Unter solchen Bedingungen erwies sich der M. semitendinosus des Ponys gegenüber Insulin weniger sensitiv als der des Schweines. Auch die ex vivo in vitro Stimulation von Muskelpräparaten mit einer supraphysiologischen Insulinkonzentration führte beim Pony zu einer deutlich geringeren Glucoseaufnahme und zu einer signifikant niedrigeren (p<0,05) GLUT-4-Translokation. Eine solche herabgesetzte Insulinsensitivität der Ponymuskulatur konnte für physiologische Insulinkonzentrationen nicht belegt werden.

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Hacker, Anja: Insulinabhängiger Glucosetransport in den Skelettmuskel von Ponys und Schweinen. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

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