Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Vergleichende funktionelle und histopathologische Untersuchungen am zentralen und peripheren Nervensystem von Ratten nach einmaliger Applikation von Natrium-Wasserstoff-Austauscher (NHE)-Inhibitoren

Hübler, Nicole

In the research laboratories of Merck KGaA (Darmstadt) so-called NHE inhibitors are developed for the treatment of acute myocardial infarction and chronic heart failure. In this connection, previous studies demonstrated CNS alterations in terms of vacuolation and axonal swelling in high dose groups after treatment with such substances. The major aim of this thesis was to describe acute findings in the CNS after treatment with two different NHE inhibitors (EMD 125021, EMD 96785). The time course and reversibility of the CNS alterations should help to better understand the mechanism of action of these inhibitors. Additionally clinical and histopathological findings were compared as well as surrogate parameters to increase safety of clinical application in humans as would be extremely beneficial. For the study, 96 female rats were divided into 3 groups (group 1 = control, group 2 = EMD 96785, group 3 = EMD 125021). The compounds were administered by intravenous injection at a single dose level. All treatment groups were divided into 4 subgroups: 8 animals per subgroup were examined 2-5 hours, 1 day, 7 days or 21 days after the treatment. At the different times motor activity was measured, and rats were tested in a Functional Observational Battery (FOB). Subsequently the animals were fixated by perfusion for the histopathological investigation of different tissues from the peripheral (sciatic nerve, optic nerve, spinal ganglia) and central (cerebellum, cerebrum, medulla oblongata, spinal cord) nervous system. The HE stain (hematoxylin and eosin) was used for all tissue samples and additionally a selection of samples were stained according to specific histological and immunohistochemical methods (Nissl Wölke Heidenhain stain, fat stain, glial fibrillary acidic protein, major histocompatibility complex class II, neurofilamentprotein, amyloid precursor protein and myelin basic protein). Alterations were seen in clinical observations at the time of 2-5 hours and 1 day after the treatment with the two NHE inhibitors. The time course of motoractivity was changed slightly after 2-5 hours. Within the first 10 minutes a decrease in activity was seen in treated animals compared to the control group. In the Functional Observational Battery (FOB) several altered parameters were detected. The treated rats showed a hunched posture, increased mobility and ataxic gait. A decrease in the number of risings was observed combined with a change in rising behaviour: animals did not rise freely in a number of cases. The treated animals showed stereotypies: a repetitive circling, an uncoordinated gait, a movement of head to and fro and a left-tilted head. Measurements of the hind limb foot splay showed increases in the treated groups. Fore- and hindlimb grip strengths were decreased after the treatment with both compounds. Additionally, the body temperature was significantly lower in the treated groups compared to the control group. The various parameters were grouped into functionally related domains and most alterations were seen in the CNS, the neuromuscular system and the physiological parameters. The histopathological alterations were only observed in the grey matter of the CNS,with no abnormality detected in the peripheral nervous system. Within the first two time points of investigation (2-5 hours and 1 day after treatment) the most prominent alterations were observed. Although partial alterations were seen 7 and 21 days after the treatment, depending on the compound and the localization within the CNS. The main diagnostic finding was a vacuolation in the grey matter in different localizations within the CNS. The most prominent vacuolation was observed in the roof nuclei and the vestibular nuclei of the cerebellum. In the majority of cases axons were seen in the vacuoles (neurofilamentprotein positive axons). Myelin basic protein (MBP) positive material was seen at the margin of the vacuoles with fibrillary MBP-positive structures extending into the lumen. From this an intramyelinic edema is suspected. Two to 5 hours after the treatment an accumulation of amyloid precursor protein was found, an early marker for pertubation of axonal transport. Large swollen axons and nerve cells were seen 7 days after the treatment with the two NHE inhibitors (EMD 125021, EMD 96785) in HE stain. Additionally 21 days after the treatment neurofilamentprotein positive large swollen axons and nerve cells were detected. The evidence of MHC-class II positive cells showed an activation of microglia 7 days after the treatment. Seven and 21 days after the treatment an astrogliosis (GFAP) was seen. The vacuolation seemed to be a primary alteration whereas the swelling of axons and nerve cells, as well as the activation of microglial cells and astrocytes, seemed to be a secondary reaction. The most prominent clinical and histopathological findings were seen after treatment with EMD 125021, when compared to EMD 96785. However, both the clinical and histopathological alterations, appear to be reversible. A good correlation between clinical findings and histopathological results was possible 2 to 5 hours and 1 day after the treatment with the NHE inhibitors. However, no correlation was possible at later time points. Early surrogate parameters (clinical markers) were not able to predict a possible toxic effect in the CNS. It is necessary to examine more closely the histopathological findings within further investigations to characterise the alterations in CNS.

In den Forschungslaboratorien der Merck KGaA (Darmstadt) werden für die Behandlung des akuten Myokardinfarktes und der chronischen Kardiomyopathie des Menschen sogenannte NHE-Inhibitoren entwickelt. In den bisher durchgeführten Sicherheitsstudien mit NHE-Inhibitoren traten bei Ratten in den hohen Dosisgruppen Veränderungen in Form einer Vakuolisierung und einer axonalen Schwellung in der grauen Substanz des zentralen Nervensystems auf. Das Ziel dieser Arbeit war eine Beschreibung der akuten Veränderungen im zentralen Nervensystem von Ratten nach der Behandlung mit zwei NHE-Inhibitoren (EMD 125021, EMD 96785) sowie eine Darstellung des zeitlichen Verlaufes, um einen Hinweis auf die Reversibilität und den möglichen Entstehungsmechanismus der Veränderungen zu erhalten. Zudem erfolgte ein Vergleich von klinischen und histopathologischen Veränderungen, um eine eventuelle Korrelation zwischen beiden aufzuzeigen. Es sollte versucht werden, Surrogat-Parameter (frühe klinische Parameter) zu finden, die eine mögliche toxische Wirkung im ZNS anzeigen ohne mit histopathologischen Veränderungen einherzugehen, um somit eine bessere Basis für die Risikobewertung hinsichtlich der Anwendung von NHE-Inhibitoren am Menschen zu erhalten.   Für den Versuch wurden 96 weibliche Ratten eingesetzt, die in drei Gruppen eingeteilt wurden (Gruppe 1 = Kontrollgruppe, Gruppe 2 = EMD 96785, Gruppe 3 = EMD 125021). Die Behandlung erfolgte mittels einer einmaligen intravenösen Injektion in die Schwanzvene. Jede Gruppe bestand aus jeweils vier Teilkollektiven, d.h., je acht Tiere pro Gruppe wurden 2-5 Stunden, 1 Tag, 7 Tage und 21 Tage nach der Behandlung klinisch und histopathologisch untersucht. Die klinische Untersuchung bestand aus einer Motoraktivitätsmessung und einer „Functional Observational Battery“. Im Anschluß wurden die Ratten perfusionsfixiert und verschiedene Gewebeproben des peripheren Nervensystems (N. ischiadicus, N. opticus, Spinalganglien) und zentralen Nervensystems (Groß- u. Kleinhirn, Medulla oblongata, Rückenmark) histopathologisch untersucht. Es wurde an allen Präparaten eine Übersichtsfärbung (HE-Färbung) durchgeführt. Im Anschluß wurden an einer Auswahl an Schnittpräparaten weitere physikalische und physiko-chemische (Nissl Wölke Heidenhain, Fettfärbung) sowie immunhistochemische Färbungen (GFAP, MHC-II, NF, APP und MBP) angewandt.   In der klinischen Untersuchung konnten lediglich zu den ersten beiden Untersuchungszeitpunkten (2-5 Stunden und 1 Tag nach der Behandlung) mit beiden NHE-Inhibitoren (EMD 125021, EMD 96785) Veränderungen festgestellt werden. Während der Motoraktivitätsmessung wurde in den ersten 10 Minuten nach der Behandlung mit den NHE-Inhibitoren eine verminderte Motoraktivität der Ratten beobachtet. In der „Functional Observational Battery“ zeigten die Tiere eine gekrümmte Körperhaltung, eine erhöhte Motilität und einen ataktischen Gang. Die Anzahl des Aufrichtens war in Kombination mit einem veränderten Aufrichtverhalten (kein freies Aufrichten) vermindert. Die Tiere zeigten Stereotypien in Form von Kreisbewegungen, einem unkoordinierten Gang, Auf- und Abbewegungen des Kopfes und einer Kopfschiefhaltung nach links. Die Fußspreizung der behandelten Ratten war erhöht und die Griffstärke der Vorder- und Hintergliedmaße vermindert. Zusätzlich wurde ein Abfall der Körpertemperatur beobachtet. Nach der Zuordnung der einzelnen Parameter zu funktionellen Einheiten (Domänen) konnte die Aussage getroffen werden, daß die veränderten Parameter überwiegend dem neuromuskulären System und dem zentralen Nervensystem sowie den physiologischen Parametern zuzuordnen sind. Die histopathologische Untersuchung ergab Veränderungen in der grauen Substanz des zentralen Nervensystems, während im peripheren Nervensystem keine Befunde festgestellt werden konnten. Die akuten histopathologischen Veränderungen waren zu den ersten beiden Untersuchungszeitpunkten (2-5 Stunden und 1 Tag nach der Behandlung) am stärksten ausgeprägt, konnten jedoch zum Teil auch noch 7 und 21 Tage nach der Behandlung (in Abhängigkeit von der Behandlungssubstanz und der Lokalisation im ZNS) festgestellt werden. Als Hauptbefund wurde eine Vakuolisierung in der grauen Substanz in bestimmten Lokalisationen des ZNS festgestellt. Vorwiegend konnte diese Vakuolisierung in den Dachhirnkernen (Nuc. medialis cerebelli, Nuc. interpositus, Nuc. lateralis cerebelli) und im Nuc. vestibularis des Kleinhirns gefunden werden. In der Mehrzahl der Vakuolen befanden sich Axone, die mit Hilfe des Neurofilamentprotein-Nachweises (NF) als solche identifiziert werden konnten. Der Nachweis des Myelinbasischen Proteins (MBP) zeigte, daß es sich bei den Vakuolen wahrscheinlich um Markscheidenödeme handelt. 2-5 Stunden nach der Behandlung zeigte sich als früher Marker für einen gestörten axonalen Transport eine Akkumulation des Amyloid Precursor Proteins (APP). Zusätzlich konnten 7 Tage nach der Behandlung mit den NHE-Inhibitoren (EMD 125021, EMD 96785) in den HE-gefärbten Präparaten geschwollene Axone und geschwollene Nervenzellen beobachtet werden, die mit dem Nachweis des Neurofilamentproteins (NF) zusätzlich am 1. und 21. Tag nach der Behandlung dargestellt werden konnten. Mit Hilfe des Nachweises des Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse-II Antigens (MHC II) wurden am 7. Tag nach der Behandlung aktivierte Mikrogliazellen festgestellt. Zusätzlich zeigte sich 7 und 21 Tage nach der Behandlung eine Astrogliose (vermehrtes GFAP-Signal). Der Hauptbefund in Form einer Vakuolisierung wurde als primäre Veränderung angesehen, während die Axon- und Nervenzellschwellung sowie die Mikrogliaaktivierung und Astrogliose als sekundäre Veränderungen eingestuft wurden. Die klinischen und histopathologischen Veränderungen waren bei den mit EMD 125021 behandelten Tieren, im Vergleich zu den mit EMD 96785 behandelten Tieren, stärker ausgeprägt und länger präsent. Es zeigte sich in der klinischen und histopathologischen Untersuchung eine deutliche Reversibilität der Veränderungen. Die Korrelation zwischen klinischen und histopathologischen Befunden konnte lediglich für die ersten beiden Untersuchungszeitpunkte (2-5 Stunden und 1 Tag nach der Behandlung) aufgezeigt werden. Frühe klinische Parameter, die eine mögliche toxische Wirkung im ZNS anzeigen, konnten im Rahmen dieser Arbeit nicht gefunden werden. Zur näheren Charakterisierung der histopathologischen Veränderungen sollten weitergehende Untersuchungen durchgeführt werden.

Quote

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Hübler, Nicole: Vergleichende funktionelle und histopathologische Untersuchungen am zentralen und peripheren Nervensystem von Ratten nach einmaliger Applikation von Natrium-Wasserstoff-Austauscher (NHE)-Inhibitoren. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

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