Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchung zur Pharmakokinetik des Arzneistoffes Dembrexin hinsichtlich der Dopingrelevanz beim Pferd

Massmann, Susanne

The aim of this study was to determine the excretion rate of dembrexine to define its pharmacokinetic behaviour when given in therapeutic doses. Evidence of dembrexine found in the blood or urine of a horse in competition is considered to be proof of doping. A suitable method for the analysis of dembrexine was developed and confirmed. The method was based upon an existing routine procedure of the Institute of Biochemistry, Deutsche Sporthochschule Köln, which uses GC/MS detection. The test was modified according to the hydrolysis method. The method was developed with plasma and urine samples from a previous experiment where a horse was given a dose of 0.3 mg/kg body weight of dembrexine intravenously. For analysis the plasma samples were hydrolyzed with ß-glucuronidase, an enzyme from E.coli, and the urine samples were treated with acidic hydrolysis. The samples were then extracted with tert.-butylmethylether and afterwards reextracted into HCI. After drying of the aqueous layer, a trimethylsilylation was performed as a derivatization and the obtained tris-TMS-derivate was measured by GC/MS. Ambroxol was used as an internal standard. Validation, performed by documentation of the recovery, selectivity, sensitivity, linearity, accuracy, precision and stability, confirmed the suitability of the method for the detection of dembrexine in plasma and urine. The limit of quantification was 50 ng/ml and the limit of detection 5 ng/ml. In the main experiment dembrexine hydrochloride was adminstered at a single intravenous dose of 0.3 mg/kg body weight to seven horses. The analysis of the substance was performed as described above. Additionally, the amount of unconjugated dembrexine in plasma was measured without hydrolysis. The maximum concentrations measured in the plasma ranged between 287 and 722 ng/ml. The terminal half-life was 1.9 ± 0.6 hours. The volume of distribution of 1.2 and 0.4 l/kg demonstrates a widespread tissue distribution. The substance could not be detected in plasma after 24 to 36 hours. The maximum concentration in the urine ranged from 4522 to 14626 ng/ml. Dembrexine could be detected in urine for up to 5 days after administration, by the 6th day the concentrations were below the limit of detection         (5 ng/ml). In the second part of the experiment dembrexine hydrochloride 1 H2O was administered at a single oral dose of 0.3 mg/kg body weight to five horses. The maximum concentrations in plasma were within the limit of quantification (24-59 ng/ml) which is why the pharmacokinetic calculations were limited. The bioavailability was < 30 %. The maximum concentrations in the urine ranged from                            1113 to 2851 ng/ml and the substance could be detected in the urine for four days after the oral administration. The pharmacokinetic data of the intravenous experiment were used for the calculation of the irrelevant concentration of dembrexine in plasma and urine according to the PK/PD-model of TOUTAIN and LASSOURD (2002). The authors suggest that a pharmocologically ineffective concentration of the drug should be calculated and then used as the limit in doping controls. The irrelevant concentration of dembrexine in plasma (IPC) was computed at between 0.1 and 0.04 ng/ml and the irrelevant concentration in the urine (IUC) between 4.1 and 2.1 ng/ml. The IUC was therefore within the limit of detection and was considered to be below this value in all the horses after 6 days. Although dembrexine could not be detected in the plasma and urine of the examined horses in this study six days after intravenous administration it does not mean that the study findings can be applied to the whole population, as far as the statement about the excretion time is concerned. The main reason are the varying plasma and urine concentrations, confirming a remarkable interindividual variability. Therefore, it seems doubtful that a specific limit can be set in doping controls (here the IUC) for dembrexine, a drug which can also be used therapeutically in chronic diseases.

Ziel der vorliegenden Arbeit war, das pharmakokinetische Verhalten von Dembrexin nach therapeutischer Dosierung zu untersuchen, um eine Aussage über die Ausscheidungszeit dieser Substanz zu treffen. Der Nachweis dieser Substanz im Blut oder Urin bei einem im Wettkampf befindlichen Pferd gilt als Doping. Zunächst wurde eine geeignete Analysemethode für Dembrexin entwickelt und validiert. Grundlage hierfür war ein bestehendes Routineverfahren im Institut für Biochemie der Deutschen Sporthochschule Köln, welches auf einem GC/MS-Nachweis beruht. Dieses wurde hinsichtlich der Hydrolysemethode modifiziert. Die Entwicklung der Methode erfolgte mit Plasma- und Urinproben aus einem Vorversuch, in dem Dembrexin einem Pferd in einer Dosierung von 0,3 mg/kg KM intravenös verabreicht wurde. Zum Nachweis von Dembrexin wurden die Plasmaproben zunächst einer Hydrolyse mit dem Enzym    ß-Glucuronidase aus E. coli, die Urinproben hingegen einer sauren Hydrolyse unterzogen. Anschließend erfolgte nach einer Extraktion mit tert.-Butylmethylether die Reextraktion der Substanz in HCl. Nach Trocknung der wässrigen Phase erfolgte als Derivatisierung eine Trimethylsilylierung und das entstandene tris-TMS-Derivat wurde mit GC/MS gemessen. Als interner Standard wurde Ambroxol verwendet. Eine durchgeführte Validierung mit Dokumentation der Winderfindungsrate, Selektivität, Sensitivität, Linearität, Richtigkeit, Präzision, und Stabilität belegte die Eignung der Methode zum Nachweis von Dembrexin in Plasma und Urin. Die Quantifizierungsgrenze lag bei 50 ng/ml, die Nachweisgrenze bei 5 ng/ml. Im Hauptversuch wurde Dembrexinhydrochlorid 7 Pferden einmalig in einer Dosierung von 0,3 mg/kg KM intravenös verabreicht. Der Nachweis der Substanz erfolgte wie oben beschrieben. Zusätzlich wurde der unkonjugierte Anteil an Dembrexin im Plasma ohne Hydrolyse bestimmt. Die im Plasma gemessenen maximalen Konzentrationen lagen zwischen 287 und 722 ng/ml. Die terminale Halbwertszeit betrug 1,9 ± 0,6 Stunden. Das Verteilungsvolumen von 1,2 ± 0,4 l/kg ließ auf eine gute Verteilung der Substanz in das Gewebe schließen. Nach 24 bis 36 Stunden war die Substanz im Plasma nicht mehr nachzuweisen. Die maximalen Urinkonzentrationen befanden sich zwischen 4522 und 14626 ng/ml. Nachgewiesen wurde Dembrexin im Urin bis zu fünf Tage nach der Applikation, am sechsten Tag lag die Konzentration bei allen Pferden unterhalb der Nachweisgrenze (5ng/ml). Im zweiten Abschnitt des Hauptversuchs wurde 0,3 mg Dembrexinhydrochlorid 1 H2O/kg KM einmalig fünf Pferden oral verabreicht. Die maximalen Konzentrationen im Plasma bewegten sich bei allen Pferden überwiegend im Bereich der Quantifizierungsgrenze (25-59 ng/ml), weshalb pharmakokinetische Berechnungen nur orientierend erfolgen konnten. Die Bioverfügbarkeit lag bei < 30 %. Die maximalen Konzentrationen im Urin lagen zwischen 1113 und 2851 ng/ml und die Substanz war bis zu vier Tagen nach der oralen Applikation im Urin nachweisbar. Die pharmakokinetischen Daten des Versuchs mit intravenöser Applikation wurden zur Berechnung der irrelevanten Plasma- und Urinkonzentration von Dembrexin nach dem PK/PD-Modell von TOUTAIN und LASSOURD (2002) herangezogen. Die Berechnung pharmakologisch unwirksamer Konzentrationen von Arzneimitteln ist ein Vorschlag der genannten Autoren für einen Grenzwert bei Dopingkontrollen. Als irrelevante Plasmakonzentration (IPC) von Dembrexin wurde 0,1 ± 0,04 ng/ml, als irrelevante Urinkonzentration (IUC) 4,1 ± 2,1 ng/ml ermittelt. Die IUC lag somit im Bereich der Nachweisgrenze von Dembrexin und galt bei allen Pferden nach 6 Tagen als unterschritten. Obwohl Dembrexin bei den hier untersuchten Pferden sechs Tage nach der intravenösen Applikation in Plasma und Urin nicht mehr nachzuweisen war, darf anhand dieser Ergebnisse keine definitive, auf die Gesamtpopulation übertragbare Aussage über die Ausscheidungszeit der Substanz gemacht werden. Grund ist in erster Linie eine Streuung der Plasma- und Urinkonzentrationen, die eine beachtenswerte interindividuelle Variabilität belegen. Die Festlegung eines Grenzwertes für Dopingkontrollen (hier der IUC) für Dembrexin, das unter anderem zur Therapie chronischer Erkrankungen eingesetzt wird, erscheint somit zweifelhaft.

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Massmann, Susanne: Untersuchung zur Pharmakokinetik des Arzneistoffes Dembrexin hinsichtlich der Dopingrelevanz beim Pferd. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

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