Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Improvement of the developmental capacity of oocytes from prepubertal cattle by intraovarian IGF-I application

Oropeza Delgado, Armando José

The goal of the present study was to improve the developmental capacity of oocytes from prepubertal cattle by either systemic application of rbST or intraovarian injection of IGF-I. Blastocyst yields and the mRNA expression pattern (relative abundance, RA) of three putative marker genes (i.e. glucose transporter-1, Glut-1; eukaryotic translation initiation factor-1A, eIF1A and upstream binding factor, UBF) were selected as criteria to determine the success of the treatments. At 6-7 months of age, thirty healthy Holstein calves were randomly assigned to three experimental groups. The first group served as control and received an intraovarian injection of 0.6 ml acetic acid. The second group received a single s.c. injection of 500 mg of somatotropin (rbST). The third group received an intraovarian injection of 6 µg rhIGF-I. During the following two weeks, follicles were aspirated 4 times via transvaginal ultrasound-guided technology. All animals were i.m. injected with 60 mg FSH 48 h prior to each aspiration. Identical treatments were repeated with the same animals at 9-10, 11-12 and 14-15 months of age. For comparison, five adult cows were i.m. injected each with 100 mg FSH and underwent oocyte retrieval. Cumulus-oocyte complexes were collected in PBS supplemented with 1% NBCS and heparin, matured in TCM-199 supplemented with hormones (eCG and hCG) for 24 h. Fertilization in vitro was carried out using frozen-thawed semen of one bull in Fert-TALP containing, heparin, hypotaurin, epinephrine and BSA fro 18-19 h. For in vitro culture, presumptive zygotes were transferred into 30 µl drops of SOF medium supplemented with BSA for 7-8 days. Two-four-cell, eight-sixteen- cell embryos and expanded blastocysts were collected at the expected time points and used for this study. Poly(A)+ RNA was isolated from pools of two embryos from each group using a commercial kit (DYNABEADS mRNA DIRECT KIT) and after elution from the beads, the Poly (A)+ RNA was transcribed into cDNA using random hexamers. Hot start PCR was performed with cDNA equivalents corresponding to 0.5 embryos for each specific primer for Glut-1, eIF1A and UBF. Rabbit globin mRNA was added to each RT-PCR as an internal standard. To optimize the amplification reaction for each pair of gene-specific primers, semilog plots of the fragment intensity as a function of cycle number were determined and the range of cycle numbers in which a linear fragment production occurred was determined and the number of PCR cycles was kept within this range. A linear range was obtained when the amount of PCR product was approximately doubled upon doubling of the initial RNA input. A linear increase in the PCR products was observed from 33 to 35 amplification cycles for Glut-1, 35-39 for eIF1A and 31-33 for UBF. For each “calf group” twenty separate RT-PCR reactions employing 2-4 cells or 8-16 cell stage embryos and 37 for each stage in the cows were performed. Fourteen expanded blastocysts from each group were analyzed. Each RT was performed with two embryos (each PCR reaction, each gene, required only 5 µl of the RT reaction while each rabbit globin PCR required only 1 µl). The following results are obtained: 1) In 556 OPU sessions 4589 follicles were aspirated and 3875 (84.4%) oocytes were recovered, of which 2152 (55.5%) were morphologically classified as belonging to categories I-III (suitable cumulus-oocyte complexes) and were used for in vitro embryo production. A total of 970 suitable oocytes were used to produce 2-4-cell and 8-16-cell embryos for RT-PCR assays and from 1182 suitable oocytes 237 (20%) expanded blastocysts were produced. 2) A total of 120 embryos at the 2-4 cell stage, 120 embryos at the 8-16 cell stage and 42 expanded blastocysts from the different treatment groups of calves were analyzed by RT-PCR. From the cows, a total of 74 embryos at the 2-4 cell stage, 74 embryos at the 8-16 cell stage and 14 expanded blastocysts were analyzed by RT-PCR. 3) The proportion of oocytes considered to be developmentally competent was higher in cows than in calves (65% vs. 58%, 50%, 52%) for the cows, control, rbST and IGF-I groups, respectively. 4) The rate of blastocysts was similar in IGF-I treated calves and cows (28% and 25%) and was higher (P ≤ 0.05) than in the control (11%). The rate of blastocysts in the rbST group was similar to the other groups. 5) Glut-1, UBF and eIF1A mRNA transcripts were detected in all stages of preimplantation embryos studied. 6) The RA for Glut-1 was lower (P ≤ 0.05) in 2-4-cell embryos from calves compared to cows. At the 8-16-cell stage Glut-1 RA was similar in IGF-I treated calves and cows. 7) The RA for eIF1A was similar in 2-4-cell embryos in all groups while at the 8-16-cell stage it was higher (P ≤ 0.05) in embryos derived from cows than those from the control group. 8) The RA for UBF was similar in 2-4-cell and in 8-16-cell embryos in all groups. 9) The RA in expanded blastocysts was similar for the three mRNA transcripts studied in all groups. 10) The RA for Glut-1 within control and cow groups decreased gradually between 2-4-cell and 8-16-cell stages and then increased again at the blastocyst stage. In contrast, within the rbST and IGF-I groups it was similar between 2-4-cell and 8-16- cell stages, and then increased at the blastocyst stage. 11) The RA for eIF1A within rbST, IGF-I and cow groups increased from 8-16-cell embryos up to the blastocyst stage. In contrast, in the control group it tended to decrease between 2-4-cell and 8-16-cell stages and then increased again at the blastocyst stage. 12) The RA for UBF within all groups decreased gradually between the 2-4-cell and 8-16-cell stages and increased again at the blastocyst stage, showing a similar pattern with most other genes expressed during preimplantation mammalian development. The increase of the RA for the three mRNA transcripts studied here at the blastocyst stage establishes a link with the increase of the glucose uptake and protein synthesis observed at this stage of embryonic development in previous studies. Results show a lower RA of the gene Glut-1 and eIF1A in the control group in comparison to cows. This could be a reason of the deficient developmental capacity of oocytes from prepubertal cattle in in vitro systems. In addition, this could explain the low glucose uptake and the deficient de novo synthesis of protein in in vitro produced embryos derived from prepubertal calves. Results demonstrated that IGF-I intraovarian injection increased blastocyst yields and expression of Glut-1 and eIF1A to levels found in the embryos produced from adult cows. This treatment appears to reduce the developmental deficiency of oocytes derived from calves and could be a step forward towards the use of prepubertal animals in breeding programs aimed at shortening the generation interval.

Ziel dieser Arbeit war die Verbesserung der Entwicklungskapazität von Oozyten präpuberaler Rinder durch Injektion von Wachstumshormon (GH) und Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor I (IGF-I, Insulin-like growth factor I). Die Blastozystenentwicklung sowie die relative Häufigkeit an Transkriptionsprodukten der Gene für den Glukosetransporter 1 (Glut-1), Eukaryotic Initiation Faktor 1A (eIF1A) und Upstream Binding Faktor (UBF) wurden als Kriterien zum Nachweis eines Behandlungseffektes herangezogen. Spendertiere für die Gewinnung von Oozyten mittels ultraschallgeleiteter Follikelpunktion (OPU) waren 30 Kälber im Alter zwischen 6 und 7 Monaten sowie fünf laktierende Kühe mit unterschiedlichem Holstein Friesian Anteil aus der institutseigenen Herde in Mariensee. Die Kälber wurden in 3 Gruppen eingeteilt. Tiere der ersten Gruppe erhielten je eine intraovarielle Injektion von 0,6 ml Essigsäure (10 mM) und dienten als Kontrollgruppe. Die zweite Gruppe erhielt eine subkutane Injektion von 500 mg rekombinantem bovinem Somatotropin (rbST), Tiere der dritten Gruppe eine intraovarielle Injektion von 6 µg IGF-I. Während der nachfolgenden 14 Tagen wurden die Kälber vier Mal (zwei Mal pro Woche) punktiert. Alle Tiere der drei Versuchsgruppen erhielten außerdem eine intramuskuläre Injektion von 60 mg FSH (Follikel Stimulierendes Hormon) 48 Stunden vor jeder Punktion. Das Behandlungs- und Punktionsprotokoll wurde im Verlauf der Untersuchungen bei den gleichen Tieren jeweils im Alter von 9-10, 11-12 und 14-15 Monaten wiederholt. Die Kühe erhielten je eine intramuskuläre Injektion von 100 mg FSH 48 Stunden vor jeder Punktion. Kumulus-Oozyten-Komplexe (KOKs) wurden in PBS mit 1% NBCS und Heparin gewonnen. Isolierte KOKs wurden in TCM199 mit Hormonzusatz (eCG und hCG) für 24 Stunden gereift bevor sie in Fert-TALP mit Heparin, Hypotaurin, Epinephrin und BSA in vitro fertilisiert wurden. Dazu wurde kryokonserviertes Sperma eines Bullen mit nachgewiesenen guter In-vitro-Fertilitätsrate verwendet. Nach 18 bis 19 Stunden erfolgte die In-vitro-Kultur in SOF mit BSA-Zusatz für 7-8 Tage. 2-4-Zell-Embryonen, 8-16-Zell-Embryonen und expandierte Blastozysten wurden für die Expressionsanalysen mittels semi-quantitativer RT-PCR eingesetzt. Dazu wurde Poly(A)+-RNA aus jeweils zwei Embryonen mit Hilfe eines kommerziell erhältlichen Isolationssystems (DYNABEADS mRNA DIRECT KIT®) isoliert. Unter Verwendung von Hexamer-Primern und MuLV-Reverse Transkriptase wurde die isolierte Poly(A)+-RNA in cDNA umgeschrieben. Der spezifische Nachweis der Genexpression von Glut-1, eIF1A und UBF erfolgte aus jeweils 0,5 Embryonenäquivalenten durch PCR-Amplifizierung der zuvor erhaltenen cDNA. Als interner Standard diente in jeder RT-PCR-Reaktion Kaninchen-Globin-mRNA. Für jedes genspezifische Primer-Paar wurden die Amplifikationsbedingungen optimiert. Dazu wurden in einer semi-logarithmischen Graphik die erhaltenen Transkriptmengen in Abhängigkeit von verschiedenen PCR-Zyklenzahlen aufgetragen. Die Zyklenzahl, in der eine lineare Amplifikation erfolgte, wurde bestimmt. Eine lineare Amplifikation wurde für Glut-1 mit 33-35 Zyklen, für eIF1A mit 35-39 Zyklen und für UBF mit 31-33 Zyklen erreicht. Die Genexpressionsanalysen an 2-4- und 8-16-Zell-Embryonen wurden für jede Kälbergruppe 20 mal, an expandierten Blastozysten sieben mal wiederholt. Aus der Gruppe der Kühe wurden die 2-4- und 8-16-Zell-Embryonen jeweils 37 mal, die expandierten Blastozysten sieben mal analysiert. Jede RT-Reaktion wurde mit jeweils zwei Embryonen durchgeführt. Für die anschließende PCR-Reaktion wurden für jedes bovinspezifische Gen 5 µl, für das Kaninchen-Globin-Gen 1 µl cDNA aus der RT-Reaktion eingesetzt. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: 1) In 556 OPU-Sitzungen wurden 4589 Follikel punktiert und 3875 (84.4%) Oozyten gewonnen. Davon wurden 2152 (55,5%) taugliche Kumulus-Oozyten-Komplexe (morphologische Klassifikation Grad I-III) für die In-vitro-Produktion (IVP) von Embryonen eingesetzt. Insgesamt wurden 970 taugliche KOKs zur Erstellung von 2-4-Zell- und 8-16-Zell-Embryonen verwendet. Aus 1182 tauglichen KOKs konnten insgesamt 237 (20%) Blastozysten produziert werden. 2) Für die Analysen der Genexpressionsmuster mittels semi-quantitativer RT-PCR wurden 120 2-4-Zell-Embryonen, 120 8-16-Zell-Embryonen und 42 expandierte Blastozysten aus den Kälbern und 74 2-4-Zell-Embryonen, 74 8-16-Zell-Embryonen und 14 Blastozysten aus den Kühen verwendet. 3) Der Anteil tauglicher KOKs war bei den Kühen signifikant höher als bei den Kälbern (65% (Kühe) vs. 58%, 50%, 52% (Kälber der Kontroll-, rbST- und IGF-I-Gruppe). 4) Ähnliche Blastozystenraten konnten bei den mit IGF-I behandelten Kälbern sowie bei den Kühen (28% und 25%) festgestellt werden. Die Kontrollgruppe lieferte im Vergleich dazu eine jeweils deutlich geringere Blastozystenrate. 5) In allen drei untersuchten Embryonalstadien konnten mRNA-Transkripte für die Gene Glut-1, eIF1A und UBF nachgewiesen werden. 6) Der relative Gehalt an Transkriptionsprodukten für Glut-1 war in 2-4-Zell-Embryonen aus Kälbern (rbST, IGF-I, Kontrollgruppe) signifikant geringer als in 2-4-Zell-Embryonen aus Kühen. In 8-16-Zell-Embryonen konnte ein signifikanter Unterschied zwischen der rbST- und der Kontrollgruppe im Vergleich zu den Embryonen aus Kühen nachgewiesen werden. Das Expressionsmuster von 8-16-Zell-Embryonen aus IGF-I behandelten Kälbern war dem der Embryonen aus Kühen ähnlich. 7) Die Transkripthäufigkeit für eIF1A war in 2-4-Zell-Embryonen aller Gruppen annähernd gleich. Eine Ausnahme bildeten Embryonen des 8-16-Zell-Stadium aus Kühen, die einen signifikant höheren relativen Transkriptionsgehalt als Embryonen aus der Kontrollgruppe aufwiesen. 8) Das Expressionsmuster für das UBF-Gen in 2-4-Zell- und 8-16-Zell-Embryonen unterschied sich in keiner der untersuchten Gruppen. 9) Expandierte Blastozysten der verschiedenen Gruppen (rbST, IGF-I, Kontrollgruppe, Kühe) zeigten keine Unterschiede im relativen Transkriptionsgehalt der drei untersuchten Gene. 10) Während der Entwicklung vom 2-4-Zellstadium zum 8-16-Zellstadium nahm die Transkripthäufigkeit für das Glut-1-Gen innerhalb der Kontrollgruppe und derjenigen der Kühe ab. In expandierten Blastozysten wurde zwischen diesen beiden Gruppen ein wieder ansteigender mRNA-Gehalt an Glut-1 nachgewiesen. In Embryonen aus den mit rbST und IGF-I behandelten Kälbern kam es zu keinem veränderten mRNA-Gehalt in 2-4-Zell- und 8-16-Zell-Embryonen. In expandierten Blastozysten nahm der relative Transkriptionsgehalt zu. 11) Vom 8-16-Zell-Stadium bis zum Stadium der expandierten Blastozysten erhöhte sich der Transkriptionsgehalt des eIF1A-Gens innerhalb der rbST- und IGF-I-Gruppe sowie derjenigen der Kühe. Bei der Kontrollgruppe konnte eine abnehmende Tendenz im relativen Transkriptionsgehalt der 2-4-Zell- und 8-16-Zell-Embryonen beobachtet werden. Bis zum Stadium der expandierten Blastozysten nahm der mRNA-Gehalt wieder zu. 12) Die Transkripthäufigkeit für das UBF-Gen nahm innerhalb der einzelnen Gruppen zwischen dem 2-4- und 8-16-Zell-Stadium ab. In expandierten Blastozysten konnte dann wieder ein erhöhter Transkriptionsgehalt dieses Gens nachgewiesen werden. Das Expressionsmuster von UBF entspricht damit dem Expressionsverlauf der meisten anderen Gene, die frühembryonal exprimiert werden. Die Zunahme des relativen Gehalts an Transkriptionsprodukten der drei untersuchten Gene in expandierten Blastozysten korreliert mit der, in der Literatur bereits mehrfach beschriebenen, gesteigerten embryonalen Aufnahme von Glukose und der Proteinsynthese in Embryonen. Die Ergebnisse zeigen einen geringeren relativen Transkriptionsgehalt der Gene Glut-1 und eIF1A in Embryonen der Kontrollgruppe im Vergleich zu Embryonen aus Kühen. Dies könnte einer der ursächlichen Mechanismen für die allgemein ungenügende Entwicklungskompetenz von Oozyten präpuberaler Rinder darstellen. Ferner könnte dieses Ergebnis auch die geringere Glukoseaufnahme und die reduzierte Proteinsynthese in vitro produzierter Embryonen aus präpuberalen Rindern erklären. Für die Erstellung in vitro produzierter Embryonen aus Oozyten präpuberaler Rinder erwies sich die intraovarielle Applikation von IGF-I in Bezug auf die Blastozystenrate als positiv. IGF-I spielt demnach eine wichtige Rolle in der Entwicklungskompetenz boviner präpuberaler Oozyten, insbesondere bei zunehmendem Alter der Tiere. Durch intraovarielle Injektion von IGF-I kann die Entwicklungsfähigkeit von Oozyten aus präpuberalen Rindern deutlich verbessert werden. Die mRNA Werte dieser Oozyten ähneln denen von Oozyten aus Kühen. Damit könnte die IGF-I Behandlung von Kälbern als ein Weg zum praktischen Einsatz in der Tierzucht zur Verkürzung des Generationsintervalls dienen.

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Oropeza Delgado, Armando José: Improvement of the developmental capacity of oocytes from prepubertal cattle by intraovarian IGF-I application. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

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