Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Erstellung [alpha]1,3-Galaktosyltransferase defizienter Schweine durch somatischen Kerntransfer und homologe Rekombination

Petersen, Björn

The goal of this project was to produce α1,3-galactosyltransferase (α1,3-Gal) deficient pigs by somatic nuclear transfer following homologous recombination.   In the first phase of the project, primary porcine fetal cells, adult porcine fibroblasts and porcine cumulous cells were produced and their growth rate was determined in two different growth media. The results allowed the selection of a cell culture system which significantly improved the proliferative properties of primary cells. This was critical  for the efficiency of subsequent steps involving the transfection of cells with a targeting vector followed by selection and clonal selection. Similarly, the effectiveness of two different methods for cell cycle synchronization was evaluated.   In the second phase of the project, donor cells exposed to a variety of preparative protocols, including exposure to agents causing cell cycle synchronization for various periods of time, were used for somatic nuclear transfer and in vitro culture. Different preparative protocols were thus evaluated for their effect on the efficiency of nuclear transfer and on the developmental potential of in vitro produced nuclear transfer embryos.   In the third phase of the project, experiments were carried out to establish a suitable transfection protocol for potential nuclear donor cells. In these experiments, a reporter gene construct (CMV-EGFP) was used so that transfection efficiency could be monitored by the expression of green fluorescent protein. These experiments led to the development of an efficient transfection protocol which was subsequently used for the transfection of donor cells with a vector which targeted integration to the gene for porcine α1,3-galactosyltransferase.   In the fourth phase, α1,3-galactosyltransferase knockout donor cells were successfully used in somatic nuclear transfer to generate α1,3-galactosyltransferase (α1,3-Gal) deficient cloned piglets.   The following results were obtained:   1)     The use of cell culture medium with 30% serum (T3-medium with 30% FCS) gave a significant increase in proliferation for all primary cells in comparison to that of normal medium.   2)     Fetal fibroblasts showed the greatest proliferation potential with 83.35 population doublings. Alteration of the caryotype was not observed.   3)     Both contact inhibition and serum reduction led to a significant enrichment of fetal fibroblasts in the G0/G1 phase of the cell cycle as compared to cycling cells (p<0.001). With either method, more than 85% of the cells were arrested in the G0/G1 phase.   4)     After blocking cell division at G0/G1, the number of cells which reentered the cell cycle after being returned to normal culture conditions was significantly lower (p<0.001) after 24 or 48 hours of contact inhibition than after either 72 or 96 hours of contact inhibition, or after exposure to reduced serum for 48 hours.   5)     The method of cell cycle synchronization had no significant influence on the blastocyst rate following nuclear transfer. A blastocyst rate of 14.0% (24 hours of contact inhibition) and 17.6% (48 hours of serum reduction) was achieved using recipient oocytes which had been matured in vitro for 40 hours. 6)     There were significantly (p<0.05) more cells (Hoechst stained nuclei) in cloned blastocysts produced from 40 hour matured recipient oocytes and donor cells exposed to 48 hours of contact inhibition, than in blastocysts produced from donor cells exposed to either 24 or 72 hours of contact inhibition.   7)     In transfection experiments with the EGFP reporter gene, three electroporation settings (240V/500µF; 260V/960 µF; 450V/350 µF) were compared for transfection efficiency but a significant difference was not seem. Approximately 40% of the cells could be successfully transfected with the EGFP reporter gene with any of the settings.   8)     After transfection of fetal fibroblasts with a knockout vector targeted to porcine α1,3-galactosyltransferase (the GGTA-1 locus), 428 G418 resistant clones were obtained. Using long range PCR, correct integration of the knockout vector in the the GGTA-1 locus was found in 9 clones.   9)     In the preliminary experiments, cloned embryos were produced by somatic nuclear transfer using fetal fibroblasts exposed to 48 hours of contact inhibition and 40 hour matured recipient oocytes. After the transfer of an average of 150 cloned embryos to four foster mothers, two pregnancies were obtained and one foster mother gave birth to four piglets. Two of those were alive and developed normally.   10)       Embryos were also produced from cloned α1,3-galactosyltransferase knockout donor cells. After the transfer to two foster mothers, one pregnancy was established. The foster mother went to term and delivered five piglets. Three of these were malformed and one died at three weeks of age for reasons which could not be determined by autopsy. The presence of the knockout vector could be demonstrated in all piglets by PCR. Two piglets, including the surviving one, had integrated the vector correctly in the targeted GGTA-1 locus. The surviving piglet has developed normally. 11)       Microsatellite analysis at 12 loci was used to exclude the possibility that the foster mother could have been the biological mother.   With the results obtained in this study, important progress has been made in the generation of transgenic animals and specifically in the production of genetically modified pigs for use in xenotransplantation experiments. The information gained from the study demonstrate the influence of cell cycle synchronization on the efficiency of somatic nuclear transfer. In addition to this, a new culture medium was established which extended the number of cell divisions which non-transformed primary cells could achieve under in vitro conditions. In this investigation, an efficient protocol was developed for the transfection of fetal fibroblast cells which made it possible to achieve targeted genetic modification of in these cells prior to using them as nuclear transfer donors. Used together, these methodological improvements resulted in the successful production of a heterozygous a1,3-galactosyltransferase deficient pig.This animal and the new techniques provide a basis for generating new transgenic pig lines carrying genes regulating human complement activity and clot formation. Using this strategy and starting from the basis of the Gal negative pig, it will be possible to generate multitransgenic pigs whose organs would be predicted to avoid both hyper acute rejection (HAR) and acute vascular rejection (AVR) following xenotransplantation into a primate model. If such tests meet expectations, multitransgenic pigs in combination with appropriate levels of immunosuppression may eventually serve as organ donors for humans, relieving the current shortage of donor organs.

Zielsetzung dieser Arbeit war die Erstellung α1,3- Galaktosyltransferase defizienter Schweine durch somatischen Kerntransfer.   Hierzu wurden in einer ersten Versuchsphase primäre foetale und adulte porzine Fibroblasten und Kumuluszellen gewonnen und das Wachstumsverhalten in zwei unterschiedlichen Zellkulturmedien untersucht. Zudem wurden zwei unterschiedliche Methoden der Zellzyklussynchronisation auf ihre Effektivität untersucht.   In der zweiten Versuchsphase wurden Spenderzellen nach unterschiedlichen Verfahren bzw. Zeitdauern der Zellzyklussynchronisation in in-vitro-Experimenten zum somatischen Kerntransfer eingesetzt und auf ihren Einfluß hinsichtlich Effizienz und Entwicklungspotential in-vitro erstellter Kerntransferembryonen untersucht.   In der dritten Versuchsphase wurden Transfektionsexperimente zur Etablierung eines geeigneten Transfektionsprotokolls potentieller Spenderzellen durchgeführt. Für diese Experimente wurde zunächst ein Reportergenkonstrukt (CMV-eGFP) verwendet und die Transfektionsrate durch Expression des grün-fluoreszierenden Proteins ermittelt. Diese Ergebnisse führten zur Entwicklung eines effizienten Transfektionsprotokolls, das für die Transfektion mit einem Knockout-Vektor für die porzine α1,3-Galaktosyltransferase eingesetzt wurde.   In der vierten Versuchsphase wurden die erstellten α1,3-Gal Knockout Spenderzellen in In-vivo-Versuchen zum somatischen Kerntransfer erfolgreich zur Generierung α1,3-Gal defizienter Klonferkel verwendet.   Folgende Ergebnisse wurden erarbeitet:   1.                 Bei Verwendung eines Zellkulturmediums mit 30%igem Serumgehalt (T3-Medium), konnte bei allen primären Zelllinien die Proliferationsfähigkeit gegenüber einem Standardkulturmedium (10% FCS) signifikant gesteigert werden.   2.                 Foetale Fibroblasten wiesen die größte Proliferationsfähigkeit mit 83,35 Populationsverdopplungen auf. Eine Änderung des Karyotyps konnte dabei nicht festgestellt werden. Eine Transformation der Zellen scheint demnach nicht zu erfolgen.   3.                 Kontaktinhibition und Serumreduktion führten zu einer signifikant erhöhten Anreicherung foetaler Fibroblasten in der G0/G1- Phase des Zellzyklus gegenüber zyklischen Zellen (p< 0,001). Mit beiden Methoden konnten mehr als 85% der Zellen in der G0/G1- Phase des Zellzyklus arretiert werden.   4.                 Nach Splitten der Zellen wurden Unterschiede in der Reversibilität der Zellzyklussynchronisation zwischen 24- und 48 stündiger Kontaktinhibition im Vergleich zu 72- und 96 stündiger Kontaktinhibition, sowie 48 Stunden serumreduzierten Zellen nachgewiesen (p< 0,001).   5.                 Die Methode der Zellzyklussynchronisation hatte keinen Einfluß auf die Blastozystenrate nach somatischem Kerntransfer. Unter Verwendung 40 h gereifter Oozyten konnten Blastozystenraten zwischen 14,0% (24 h Kontaktinhibition) und 17,6% (48 h Serumreduktion) erzielt werden.   6.                 Innerhalb der Gruppe geklonter Embryonen aus 40 h gereiften Oozyten als Empfängerzellen wiesen Blastozysten aus 48 h kontaktinhibierten Spenderzellen signifikant mehr Kerne auf, als Blastozysten, die aus 24 h und 72 h kontaktinhibierten Spenderzellen erstellt wurden (p< 0,05).   7.                 In Transfektionsexperimenten mit einem EGFP- Reportergen wurden drei Elektroporationsparameter (240V/ 500μF, 260V/ 960μF, 450V/ 350μF) auf ihre Transfektionseffizienz untersucht. Ein signifikanter Unterschied konnte nicht festgestellt werden. Ca. 40% der Zellen konnten erfolgreich mit dem EGFP- Reportergenkonstrukt transfiziert werden.   8.                 Nach Transfektion foetaler Fibroblasten mit einem Knockout-Vektor für die porzine α1,3-Galaktosyltransferase (GGTA-1 Locus), konnten 428 G418- resistente Zellklone gewonnen werden. Durch Long- Range PCR wurde in 9 Klonen eine korrekte Integration des Knockout- Vektors in den α1,3- Galaktosyltransferase Locus nachgewiesen.   9.                 In Vorversuchen zum somatischen Kerntransfer wurden unter Verwendung   48 h kontaktinhibierten foetalen Fibroblasten und 40 h gereiften Eizellen Kerntransferembryonen erstellt. Nach Übertragung von durchschnittlich jeweils 150 geklonter Embronen auf 4 Empfängertiere, konnten 2 Trächtigkeiten etabliert werden; ein Empfängertier kam zur Geburt und warf 4 Ferkel. Hiervon waren 2 vital und entwickeln sich bis heute normal.   10.             Unter Verwendung eines Galaktosyltransferase- Knockout Klons wurden geklonte Embryonen erstellt. Nach Übertragung auf 2 Empfängertiere konnte  eine Trächtigkeiten etabliert werden. Das Empfängertier kam zur Geburt und warf 5 Ferkel. 3 Ferkel wiesen Missbildungen auf und 1 Ferkel verstarb nach 3 Wochen aus unbekannter Genese. In allen Ferkeln konnte der Knockout- Vektor durch PCR nachgewiesen werden. 2 Ferkel, darunter das Überlebende, wiesen eine korrekte Integration in den GGTA-1 Locus auf. Das Ferkel entwickelt sich bis heute normal.   11.             Durch Mikrosatellitenanalyse von 12 verschiedenen DNA- Loci konnte in allen Kerntransferversuchen das Empfängertier als biologische Mutter ausgeschlossen werden.   Mit den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit wurden wichtige Fortschritte im Hinblick auf die Generierung transgener Tiere insbesondere für die Verwendung genetisch veränderter Schweine für die Xenotransplantation erzielt. Die in dieser Arbeit ermittelten Ergebnisse weisen den Einfluss der Zellzyklussynchronisation auf die Effizienz des somatischen Kerntransfers nach. Zudem konnte ein neuartiges Zellkulturmedium entwickelt werden, das die Lebensspanne primärer Zellen unter in-vitro-Bedingungen verlängert und das Hayflick-Limit überwindet. Ein effizientes Transfektionsprotokoll für foetale Fibroblasten wurde erarbeitet, mit dessen Hilfe die gezielte genetische Modifikation porziner Fibroblasten möglich ist. Die in der vorliegenden Arbeit erzielten Ergebnisse konnten erfolgreich für die Generierung eines heterozygot α1,3-Galaktosyltransferase defizienten Schweines durch somatischen Kerntransfer angewandt werden. Dieses Tier kann als Grundlage für die Generierung neuer transgener Schweinelinien dienen, die zusätzliche humane komplement- und koagulationsregulatorische Gene tragen. Auf der Basis Gal-negativer Schweine könnten Schweine generiert werden, die eine Überwindung der HAR und der später auftretenden AVR nach Xenotransplantation im Primatenmodell gewährleisten können. Sollte sich diese Einschätzung bewahrheiten, könnten multitransgene Schweine, in Kombination mit geeigneten Immunsuppressiva, in absehbarer Zeit als Organdonoren eingesetzt werden und so helfen, das akute Problem des Spenderorganmangels zu minimieren.

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Petersen, Björn: Erstellung [alpha]1,3-Galaktosyltransferase defizienter Schweine durch somatischen Kerntransfer und homologe Rekombination. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

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