Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Adenoviral vermittelte Überexpression von Matrixmetalloproteinasen zur funktionellen Charakterisierung ihrer Rolle für das hepatische tissue remodeling

Rudowitz, Daniela

Nearly all components of the extracellular matrix (ECM) are subject to degradation by the family of matrix metalloproteinases (MMPs). These enzymes play an important role in the tissue remodeling of the liver. This work aimed to contribute to the functional characterization of MMPs in the liver, not only with regard to their proteolytic activity, but also to non-proteolytic interactions. The impact of an overexpression of MMP-2, MMP-3 and MMP-9 in murine liver on the mRNA expression of MMP-2, TIMP-1 and type IV procollagen was studied. Effects of proteolytic inactive variants of these MMPs on the same parameters were explored to differentiate between effects based on proteolytic activity and those based on protein-cell-interactions. Proteolytic inactivity was achieved by targeted mutagenesis which generated a change in the amino acid sequence within the zinc binding motif of the catalytic domain. Recombinant adenoviruses were cloned to allow hepatic overexpression of MMPs. These viruses included the coding sequence (CDS) for MMP-2, MMP-3 and MMP-9 as well as for their proteolyticly inactive variants. A recombinant adenovirus with no additional genetic information served as a negative control. After demonstration of adenoviral mediated MMP expression, proteolytic activity and mutant inactivity in vitro, we studied MMP overexpression in vivo in mice. In addition to the course of expression of the induced MMPs, RNA expression of MMP-2, TIMP-1 and type IV procollagen (a1­chain) was detected. Therefore, competetive RT-PCR assays for MMP-2, MMP-3, MMP-9, TIMP­1 and type IV procollagen were established. After a single dose of adenovirus, all of the studied wild-type and mutant MMPs showed an enhanced expression both at the transcriptional level and at the translational level for up to three weeks p.i.. Additionally, increased mRNA-levels for MMP-2 and TIMP-1 were detected in all groups. In contrast, type IV procollagen mRNA decreased. None of the studied parameters changed after injection of the negative control virus. In this study, effects of overexpressed MMPs on the mRNA expression of MMP-2, TIMP-1 and type IV procollagen were demonstrated. These effects appeared to be independent from proteolytic activity.

Fast alle Bestandteile der extrazellulären Matrix (EZM) können von den Mitgliedern der Familie der Matrixmetalloproteinasen (MMPs) degradiert werden. Diese Proteasen spielen für das tissue remodeling der Leber eine große Rolle. Mit dieser Arbeit sollte ein Beitrag zur funktionellen Charakterisierung der MMPs in der Leber geleistet werden, der über die reine Deskription der proteolytischen Aktivität der MMPs hinausgeht und auch nicht-proteolytische Interaktionen berücksichtigt. Es wurden die Effekte einer Überexpression von MMP-2, MMP-3 und MMP-9 in muriner Leber auf die Expression von MMP-2, TIMP-1 und Typ IV-Prokollagen untersucht. Zur Abgrenzung der Effekte, die auf proteolytischer Aktivität beruhen, von denjenigen, die durch Protein-Zell-Interaktionen zustande kommen, wurden daneben die Effekte von proteolytisch-inaktiven Varianten dieser MMPs auf die selben Zielparameter hin untersucht. Die proteolytische Inaktivität wurde mittels zielgerichteter Mutagenese durch einen Aminosäure-Austausch im Bereich des Zinkbindungsmotivs erzielt. Zur hepatischen Expression der MMPs wurden rekombinante Adenoviren kloniert, die die kodierende Sequenz (CDS) von MMP-2, MMP-3, MMP-9 sowie die der proteo-lytisch inaktiven Varianten generierten. Als Negativkontrolle wurde ein rekombinantes Adenovirus verwendet, welches keine zusätzliche genetische Information beinhaltete. Nach Beweis der Adenoviral-vermittelten MMP-Expression und deren proteolytischer Aktivität, bzw. Inaktivität der Mutanten in vitro wurden die Effekte einer Überexpression in vivo im Mausmodell untersucht. Zielparameter der Untersuchung waren neben dem Expressionsverlauf der induzierten MMPs die RNA-Expression von MMP-2, TIMP-1 und Typ IV-Prokollagen (a1-Untereinheit). Hierfür wurden quantitative Echtzeit-RT-PCR-Assays für MMP-2, MMP-3, MMP-9, TIMP-1 und Typ IV-Prokollagen etabliert. Nach einmaliger Adenovirus-Gabe ließ sich für alle untersuchten MMPs und deren Mutanten eine vermehrte Expression auf Transkriptions- und Translations-Ebene bis zu drei Wochen p.i. nachweisen. Nach Überexpression aller MMPs wurden sekundär sowohl für MMP-2 als auch für TIMP-1 erhöhte mRNA-Konzentrationen gemessen, wohingegen die mRNA-Expression von Typ IV-Prokollagen verringert war. Keiner der untersuchten Zielparameter zeigte sich nach Gabe des Kontrollvirus verändert. Zusammenfassend konnten also Effekte der überexprimierten MMPs sowohl auf die Expression von MMP-2 und des spezifischen Inhibitors TIMP-1 als auch auf die Expression des Basalmembran-vernetzten Typ IV-Kollagens gezeigt werden, die sich unabhängig von der proteolytischen Aktivität der MMPs darstellten.

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Rudowitz, Daniela: Adenoviral vermittelte Überexpression von Matrixmetalloproteinasen zur funktionellen Charakterisierung ihrer Rolle für das hepatische tissue remodeling. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

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