Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Durchflusszytometrische Untersuchung caniner Mikrogliazellen

Schröder, Simone

Microglial cells are known to be the most important immune effector cells of the CNS. They can be activated by numerous physiological and neuropathological stimuli. Activated microglia is characterized by the ability of antigen-presentation and de novo-expression of surface antigens, for the release of numerous secretory products such as reactive oxygen species (ROS) as well as for phagocytosis. The aim of the study was to search for immunophenotypical and functional differences of microglia in dogs with and without intracranial diseases by flow cytometric techniques of ex vivo-isolated cells as well as to optimize the applied method of functional examinations. Microglia was isolated by density gradient centrifugation and identified by their CD18/CD11b/CD11c-positive as well as CD45low- or CD45-negative phenotype. For comparison monocytes isolated from peripheral blood were examined. The results of the indirect membrane immunofluorescence were heterogenous. While the microglial cells of all dogs expressed the same surface molecules, differences in the amount of expression did not reveal any tendency towards a special disease group. However, a distinctive feature was shown regarding the expression of CD45. While in 14 dogs CD45 could only be detected on few microglial cells, in 6 dogs with intracranial disease most of the microglia showed CD45 expression with low intensity. This has been interpreted as a stimulation of the cells to express CD45 that has taken place in vivo. Altogether the expression of CD45 on canine microglia was very low compared to other species. Because of the different expression pattern of monocytes and microglial cells it was possible to exclude contamination of tissue macrophage and post mortem into the brain migrated monocytes. Performing functional examinations (ROS-production, phagocytosis activity) of canine microglial cells slightly elevated activity in single dogs occured but no tendency has been shown for a certain group of disease. To examine the phagocytic activity microglial cells were incubated with FITC-labelled, heat-inactivated Staphylococcus aureus bacteria. Opsonization improved the phagocytosis by canine microglia. With the use of the extracellular fluorescence quenching dye trypanblue a strong adherence of staphylococcus to the microglial cell surface besides internalisation of bacteria could be demonstrated. With this method the real phagocytosis ability of canine microglial cells could be detected precisely. The detection of reactive oxygen species (ROS) development by the microglial cells showed that even the addition of a high concentration of the cell stimulating substance PMA induced only a weak ROS-synthesis by the microglial cells in contrast to a previous study with canine distemper virus infection. Despite existing ROS-building ability of the cells the microglia seemed to need specific activating mechanisms to produce ROS. Therefore the sensitive brain tissue is better protected against “innocent bystander”-damage caused by ROS. After the use of a cushion of Histopaque® results of measurement of the ROS-production was enhanced suggesting adherence of activated microglial cells on plastic material. Results of the immunophenotypical and functional examination of the microglia ex vivo indicated an important function of the microglia in the CNS as immune effector cells. How far the detected immunophenotypes and functional activity of the microglial cells in this given study is a characteristic for different canine intracranial diseases will be evaluated in future studies. The use of trypanblue in the phagocytosis assay as well as of a cushion of Histopaque® in the ROS assay is be recommended.

Mikrogliazellen gelten als die wichtigsten Immuneffektorzellen des ZNS. Sie werden durch eine Vielzahl von physiologischen und neuropathologischen Stimuli aktiviert, woraufhin sie sich zur aktivierten Mikroglia umwandeln. Die aktivierte Mikroglia ist unter anderem charakterisiert durch die Fähigkeit zur Antigen-Präsentation und de novo-Expression von Oberflächenantigen, zur Freisetzung einer Vielzahl sekretorischer Produkte wie reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) sowie zur Phagozytose. Ziel dieser Arbeit war, Mikrogliazellen ex vivo zu isolieren, um Unterschiede zwischen Hunden mit intrakraniellen und extrakraniellen Erkrankungen herauszustellen sowie die angewandte Methodik bei funktionellen Untersuchungen zu optimieren. Mikrogliazellen wurden mittels Dichtegradientenzentrifugation isoliert und anschliessend unter Verwendung der Durchflusszytometrie anhand ihres CD18/CD11b/CD11c-positiven sowie CD 45low- oder CD45-negativen Phänotyps identifiziert sowie immunphänotypisch und funktionell untersucht. Vergleichend wurden Monozyten, die ebenfalls mittels Dichtegradientenzentrifugation aus dem peripheren Blut isoliert wurden, untersucht. Die Resultate der indirekten Membranimmunfluoreszenz ergaben ein heterogenes Bild bezüglich der immunphänotypischen Eigenschaften der caninen Mikroglia. Zwar exprimierten diese Zellen aller Hunde die gleichen Oberflächenmoleküle. Für die beobachteten Schwankungen in der Expressionsdichte konnte jedoch keine Tendenz hinsichtlich einer Erkrankungsgruppe erkannt werden. Eine Auffälligkeit zeigte sich allerdings in der Expression von CD45. Während CD45 bei 14 Hunden nur auf einem geringen prozentualem Anteil der Mikroglia nachweisbar war, konnte bei sechs Hunden mit intrakraniellen Erkrankungen ein hoher Anteil an positiven Mikrogliazellen mit schwacher Expression festgestellt werden. Dies wurde im Zusammenhang mit der intrakraniellen Erkrankung der Hunde als in vivo-stattgefundene Stimulierung der Zellen zur CD45-Expression gedeutet. Insgesamt erwies sich die Expression von CD45 auf caniner Mikroglia im Unterschied zu anderen Spezies als sehr gering. Aufgrund unterschiedlicher Expressionsmuster konnte ausgeschlossen werden, dass in der untersuchten Mikrogliazellpopulation Gewebsmakrophagen bzw. post mortem ins Hirnparenchym diffundierte Monozyten enthalten waren. Die Resultate der funktionellen Untersuchungen (ROS-Bildung, Phagozytoseaktivität) der caninen Mikrogliazellen deuteten zwar für einzelne Hunde geringfügig erhöhte Aktivitäten an, jedoch zeigte sich auch hier keine Tendenz für eine spezielle Krankheitsgruppe. Zur Überprüfung der Phagozytoseaktivität wurden den Mikrogliazellen Fluoreszeinisothiocyanat-markierte, hitzeinaktivierte Staphylokokken zur Phagozytose angeboten. Dabei zeigte ein Teil der Mikrogliapopulation Phagozytoseaktivität auf, die durch Opsonisierung der Bakterien verstärkt wurde. Der Einsatz des fluoreszenzmindernden Farbstoffs Trypanblau deckte eine starke Adhärenz der Bakterien an der Mikrogliazelloberfläche auf. Durch Zugabe von Trypanblau konnte die tatsächliche Phagozytoseaktivität der caninen Mikrogliazellen präzise ermittelt werden. Beim Nachweis der Bildung von Sauerstoffradikalen (ROS) durch die Mikrogliazellen zeigte sich, dass selbst die Zugabe einer hohen Konzentration der zellstimulierenden Substanz PMA die Mikroglia zu einer nur schwachen ROS-Synthese veranlasste. Trotz vorhandener ROS-Bildungsfähigkeit der Zellen scheint die Mikroglia spezifischere Aktivierungsmechanismen zu benötigen, um ROS zu bilden. Die ROS-empfindlichen Hirnstrukturen sind somit vor „innocent bystander“-Schädigung besser geschützt. Nach Einsatz eines Histopaque®-Polsters wurde die Messung der ROS-Bildungsfähigkeit deutlicher, was eine teilweise Adhärenz aktivierter Zellen am Plastikmaterial vermuten lässt. Die Ergebnisse der immunphänotypischen und funktionellen Untersuchung der Mikroglia ex vivo sprechen für eine wichtige Funktion der Mikroglia im ZNS als Immuneffektorzelle. Weiterführende Studien müssen klären, ob Immunphänotyp und funktionelle Aktivität der Mikrogliazellen charakteristisch für eine jeweilige Krankheit sein kann. Der Einsatz von Trypanblau im Phagozytose-Assay sowie der eines Histopaque-Polsters im ROS-Assay sind dabei aufgrund der aussagekräftigeren Resultate zu empfehlen.

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Schröder, Simone: Durchflusszytometrische Untersuchung caniner Mikrogliazellen. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

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