Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Charakterisierung von antiosteoporotischen Aktivitäten und Faktoren im Tiermodell der ovarektomierten beziehungsweise gastrektomierten Ratte als Osteoporose-Modell

Stephan, Susanne

The post-menopausal osteoporosis with the potentially following elevated fracture incidence is a continuously growing problem. Therefore there is a big interest in the development of agents with an osteoanabolic effect. Literature analysis makes clear that the acid producing part of the stomach of rats and chicken may be a site producing of a peptide hormone that influences bone turnover and stability. For the present dissertation work both an extract of 103 pig stomachs and 420 liter hemofiltrate was used to purify chromatographically and characterize osteoanabolic substances in vitro. The identification of these osteoanabolic activities was based on measuring the induction of the activity of membrane bound alkaline phosphatase and the cell viability/number in cells derived from bone marrow as well as the osteosarcoma cell line ROS-17/2.8. The characterization was completed by a Subtilisin digest and inhibition of activity by the steroid receptor antagonist mifepristone. The following in vivo characterization was done using the established osteoporosis animal model of the ovariectomized rat. Therefore 8 groups with each time 5 animals were arranged and treated subcutaneous for a period of 60 days. 2 groups were sham-operated. One group served as a control and was treated with physiological salt solution, the other one with an in vitro active fraction derived from porcine stomach. The remaining animals were ovariectomized treated with physiological salt solution as control, hPTH 1-37 and 17-b estradiol as positive control as well as the in vitro active fractions derived from porcine stomach and hemofiltrate in two concentrations. After killing the rats the femura and calvaria were excised and examined by X-ray as well as physical, morphological and histomorphometrical methods. Moreover serum samples taken on different days during the experiment were tested for biochemical parameters like serum calcium and osteocalcin levels. Data show that ovariectomy resulted in osteopenia. There was no proof for the presence of an osteoanabolic effect in porcine stomach and partly for the hemofiltrate extracts. While hPTH had a significant osteoanabolic effect, it could not be proven for the treatment with 17-b-estradiol. An additional purification of the porcine stomach sample and analysis by ESI-spectrometry and MS/MS fragmentation revealed that the activity is the glucocorticoid hydrocortisone. The purification of the hemofiltrate sample and following analysis with ESI- and NMR-spectrometry showed that it is likewise hydrocortisone as well as in addition to that the synthetic glucocorticoid prednisolone. In this work the gastrectomy animal model was investigated for its suitability as an osteoporosis model. Therefore 5 adult and 5 young animals were gastrectomized without any further treatment. Parallel 5 adult and 5 young animals were taken as a control group. After 42 days the femura and calvaria were prepared and examined corresponding to the ovariectomy study. In opposite to the findings in the young animals there was no change in the calvarial structure of the adult rats. Taken together the osteopenia is more pronounced in the younger animals than in the older ones. The suitability of the gastrectomy model to explore the gastrectomy-induced osteoporosis and the evaluation of potential substances for the treatment of this disease is supported by the data of this study but needs father standardization with respect to age, sex, duration of treatment and method of treatment from the animals.

Da die postmenopausale Osteoporose mit ihren möglichen Folgefrakturen ein zunehmend wichtiges Problem darstellt, ist die Entwicklung neuer osteoanabol wirkender Medikamente von erheblicher Bedeutung. Die Auswertung der Literatur verdeutlicht, daß der säureproduzierende Teil des Magens bei Ratten und Hühnern als möglicher Bildungsort eines Peptidhormones in Frage kommt, das Einfluß auf den Knochenaufbau nimmt. Für die vorliegende Arbeit wurde jeweils ein Extrakt aus 103 Schweinemägen und 420 Liter Hämofiltrat chromatographisch aufgereinigt, um osteoanabole Substanzen in vitro zu identifizieren und zu charakterisieren. Die Identifizierung erfolgte durch Stimulierung der membrangebundenen alkalischen Phosphatase und durch Messung der Zellvitalität (WST-1) von Knochenmarkstamm- und ROS-17/2.8 Zellen. Die Charakterisierung wurde mittels Subtilisinverdau und durch eine Aktivitätshemmung mit dem Steroidrezeptorantagonisten Mifepriston durchgeführt. Die anschließende in vivo Charakterisierung erfolgte mit dem etablierten Osteoporose-Tiermodell der ovarektomierten Ratte. Dazu wurden 8 Gruppen mit je 5 Tieren zusammengestellt und über eine Dauer von 60 Tagen subkutan behandelt. 2 Gruppen wurden sham-operiert und eine davon wurde als Kontrollgruppe mit physiologische NaCl-Lösung, die andere mit einer in vitro aktiven Probe aus Schweinemagen behandelt. Die restlichen Tiere wurden ovarektomiert und erhielten NaCl als Kontrolle, hPTH 1-37 und 17-b Östradiol als Positivkontrollen, sowie die in vitro aktiven Proben aus Schweinemagen und Hämofiltrat in zwei Konzentrationen. Nach Tötung der Ratten wurden die Femura und Calvariae entnommen und röntgenologischen, physikalischen, morphologischen und histomorphometrischen Untersuchungen unterzogen. Darüber hinaus wurden mit entnommenen Serumproben biochemische Untersuchungen durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, daß die Ovarektomie zu einer Osteopenie führte. Den Schweinemagenproben konnte keine und den Hämofiltratproben zum Teil eine osteoanabole Wirkung nachgewiesen werden. Während PTH eine deutliche osteoanabole Wirkung hatte, konnte dies durch die Behandlung mit 17-b-Östradiol nicht nachgewiesen werden. Eine weitere Aufreinigung der Schweinemagenprobe und Analyse durch ESI-Spektrometrie und MS/MS Fragmentierung ergab, daß es sich um das Glukokortikoid Hydrokortison handelte. Die Aufreinigung der Hämofiltratprobe und folgende Analysen mittels ESI- und NMR-Spektrometrie ergaben, daß es sich hier ebenfalls um Hydrokortison sowie zusätzlich um das synthetische Glukokortikoid Prednisolon handelte. In der vorliegenden Arbeit wurde weiterhin das Gastrektomie-Tiermodell auf seine Eignung als Osteoporose-Modell beurteilt. Dazu wurden 5 adulte und 5 junge Tiere gastrektomiert, aber keiner Behandlung unterzogen. Parallel dazu wurden 5 adulte und 5 junge Tiere als Kontrollgruppen gehalten. Nach 42 Tagen wurden entsprechend der Ovarektomie-Studie die Femura und Calvariae präpariert und untersucht. An den Calvariae der adulten Ratten konnten im Gegensatz zu den jungen Tieren keine Veränderungen festgestellt werden. Insgesamt beurteilt war die Osteopenie bei den jüngeren Tieren stärker ausgeprägt, als bei den ältern Tieren. Die Eignung des Gastrektomie-Tiermodells für die Erforschung der gastrektomie-Osteoporose und die Evaluierung eventueller Substanzen zur Behandlung dieser Erkrankung wird durch die Daten dieser Gastrektomie-Studie unterstützt und bedarf aber einer Standardisierung hinsichtlich Alter, Geschlecht, Behandlungsdauer und Behandlungsart der Tiere.

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Stephan, Susanne: Charakterisierung von antiosteoporotischen Aktivitäten und Faktoren im Tiermodell der ovarektomierten beziehungsweise gastrektomierten Ratte als Osteoporose-Modell. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

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