Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Interaktion zwischen Metabolismus und Transport von Pyren in Caco-2-Zellen als Modell der gastrointestinalen Barriere

Stumkat, Lutz

Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH´s) represent a class of substances formed in all types of incomplete combustion of organic compounds. Some of its members have - due to certain molecular structure chracteristics –  procarcinogenic properties in both man and laboratory animals. PAH´s are metabolized within the organism by the almost ubiquitous classes of cytochrome P450 enzymes and epoxide hydrolases (functionalization, phase 1) and sulfotransferases, UDP-glucuronosyltransferases and glutathione-S-transferases (conjugation, phase 2). The enzymatic reactions of phase 1 result in an increased reactivity with cellular macromolecules (including DNA), but are also the prerequisite for phase 2 reactions which increase the molecules´ hydrophilicity decisively, enabling the organism to excrete the PAH´s via the kidney, the bile and (as recently shown for the carcinogenic PAH benzo[a]pyrene) the intestinal mucosa. In the present work, the existence of a biphasic metabolism and a subsequent metabolite transport via the intestinal epithelium was examined and demonstrated for the noncarcinogenic PAH pyrene, including the identification of the participating enzymes, their products and the proteins involved in the transport. The human intestinal cell line Caco-2 was chosen as a model for the intestinal epithelium by reason of its close similarity (in morphology and  cellular biochemistry) with small bowel enterocytes. The ability of different human sulfotransferases to metabolize pyrene and pyrene-1-hydroxide was examined in the hamster cell line V79, the role of the transport protein cMOAT/MRP2 in the metabolite transport was investigated using the canine cell line MDCK II. The results can be summarized as follows: 1.      In Caco-2 cells, pyrene is metabolized to pyrene-1-hydroxide (phase 1). 2.      The hydroxilation of pyrene is carried out mainly by the cytochromes P450 1A1, P450 1A2 and/or P450 1B1. This reaction is inducible by several CYP1A1 inductors and can be inhibited by α-naphtoflavone, an inhibitor of CYP1A1, CYP1A2 and CYP1B1. 3.      Pyrene-1-hydroxide is metabolized by Caco-2 cells to pyrene-1-glucuronide and pyrene-1-sulfate. 4.       Pyrene-1-hydroxide is a substrate for the human sulfotransferases hSULT1A2*1, hSULT1A1*Arg, hSULT1A3 and hSULT1B1. 5.      Pyrene-1-sulfate formed in the cytosol is transported by Caco-2 cells in a directed manner across the apical cytoplasma membrane, unless a pharmacological inhibition of transport proteins is imposed. 6.      The results indicate that pyrene-1-glucuronide, too, is subjected to a directed transport into the apical direction. Pyrene and pyrene-1-hydroxide, however, are not transported in a directed way.                                                                       7.      The transport protein cMOAT/MRP2 does not transport pyrene-1-sulfate. 8.      Pyrene-1-sulfate (and, presumably, also pyrene-1-glucuronide) are substrates of the ABC transport protein BCRP that is also expressed in intestinal cells in vivo. The direction of pyrene-1-sulfate (and, as indicated by the experimental results, also pyrene-1-glucuronide) transport is reversed using Ko 143, an inhibitor of this transport protein. 9.      Pyrene and its metabolites formed in Caco-2 cells do not induce the mRNA expression of CYP1A1, CYP1B1, hSULT1A1, hSULT1B1, UGT1A6 and the transmembrane transport proteins p-glycoprotein and cMOAT/MRP2. A metabolization of pyrene following the aforementioned metabolic pathways can also be postulated for the human small intestine. The interaction of metabolism and transport of PAH´s in the human intestinal mucosa is not limited to the carcinogenic members of the PAH class, even though pyrene, unlike many carcinogenic PAH´s, does not induce its own phase 1- and phase 2 metabolism. Notably, the differences between the amounts of pyrene-1-sulfate transported into the apical and basolateral directions are less distinct than those for benzo[a]pyrene-1- and –3-sulfate, these two compounds  being transported much more efficiently into the apical direction by Caco-2 cells  under similar experimental conditions (BÜSEN et al., 2002). This indicates a lower affinity of the apical transport protein(s) for the pyrene metabolite in comparison with the corresponding conjugated metabolites of carcinogenic PAH´s like benzo[a]pyrene, or, in other words, an optimization of protection against carcinogens.

Polyzyklische Aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK´s) bilden eine Klasse von Substanzen, die bei allen Arten unvollständiger Verbrennung organischer Verbindungen gebildet werden. Manche ihrer Vertreter haben – aufgrund bestimmter Charakteristika der Molekülgestalt – die Eigenschaften von Prokanzerogenen bei Mensch und Versuchstieren. Die Metabolisierung der PAK´s erfolgt im Organismus durch die nahezu ubiquitär vorhandenen Enzymklassen der Cytochrom-P450- Enzyme und der Epoxidhydrolasen (Funktionalisierung, Phase 1) sowie der Sulfotransferasen, UDP-Glucuronosyltransferasen und Glutathion-S-Transferasen (Konjugation, Phase 2). Die enzymatischen Reaktionen der Phase 1 bewirken bei PAK´s eine gesteigerte Reaktivität gegenüber zellulären Makromolekülen (einschließlich der DNS), sind andererseits aber Voraussetzung für die Reaktionen der Phase 2, welche die Hydrophilie des Moleküls entscheidend erhöhen und damit dessen Exkretion durch aktiven Transport über die Nieren, die Gallenflüssigkeit und – wie kürzlich für den kanzerogenen PAK Benzo[a]pyren gezeigt werden konnte – das Darmepithel ermöglichen. Das Vorhandensein einer derartigen Interaktion von zweiphasigem Metabolismus und nachfolgendem gerichtetem Transport der Metaboliten durch das Darmepithel sollte im Rahmen der vorliegenden Arbeit für den nichtkanzerogenen PAK Pyren untersucht und gezeigt werden. Die Identifizierung der beteiligten Enzyme, ihrer Produkte sowie der am Transport beteiligten Proteine bildeten weitere Fragestellungen. Als Modell für das Darmepithel wurde aufgrund ihrer vielfältigen morphologischen und biochemischen Gemeinsamkeiten mit Dünndarmenterozyten die humane Zellinie Caco-2 gewählt.  Die Beteiligung verschiedener humaner Sulfotransferasen am Pyrenmetabolismus wurde an der Hamsterzellinie V79, die Rolle des Transportproteins cMOAT/MRP2 unter Verwendung der caninen Zellinie MDCK II geprüft. Zusammengefaßt lassen sich die Ergebnisse folgendermaßen charakterisieren: 1.      In Caco-2-Zellen findet eine Metabolisierung von Pyren zu Pyren-1-Hydroxid statt (Phase 1). 2.      Die Hydroxylierung des Pyrens erfolgt größtenteils durch die Cytochrome P450 1A1, P450 1A2 und/oder P450 1B1. Diese Reaktion ist durch verschiedene Induktoren des CYP1A1 induzierbar und kann durch den CYP1A1-, CYP1A2- und CYP1B1-Inhibitor α-Naphtoflavon gehemmt werden. 3.      Pyren-1-Hydroxid wird von Caco-2-Zellen zu Pyren-1-Glucuronid und Pyren-1-Sulfat metabolisiert (Phase 2). 4.      Die humanen Sulfotransferasen hSULT1A2*1, hSULT1A1*Arg, hSULT1A3 und hSULT1B1 sind zur Sulfatierung von Pyren-1-Hydroxid befähigt. 5.       Pyren-1-Sulfat wird (sofern keine pharmakologische Inhibition von Transportproteinen stattfindet), von Caco-2-Zellen gerichtet nach apikal transportiert. 6.       Es sind Hinweise dafür vorhanden, daß auch Pyren-1-Glucuronid in Caco-2-Zellen einem gerichteten Transport nach apikal unterliegt.       Es findet kein gerichteter Transport von Pyren und Pyren-1-Hydroxid  statt.                                                                                                                               7.      Das Transportprotein cMOAT/MRP2 ist nicht verantwortlich für den Transport von Pyren-1-Sulfat. 8.      Pyren-1-Sulfat und wahrscheinlich auch Pyren-1-Glucuronid sind Substrate für das auch in intestinalen Zellen in vivo exprimierte ABC-Transportprotein BCRP. Durch eine pharmakologische Inhibition dieses Transportproteins (in diesem Fall durch Ko 143) ist die Richtung des Transportes von Pyren-1-Sulfat und wahrscheinlich auch Pyren-1-Glucuronid nach basolateral umkehrbar. 9.      Pyren und seine in Caco-2-Zellen gebildeten Metabolite induzieren die Expression der Enzyme CYP1A1, CYP1B1, hSULT1A1, hSULT1B1, UGT1A6 und der transmembranären Transportproteine P-Glykoprotein und cMOAT/MRP2 in diesen Zellen nicht. Für den humanen Dünndarm ist nach den Ergebnissen dieser Experimente ebenfalls die Metabolisierung von Pyren im Rahmen der beschriebenen Metabolismuswege anzunehmen. Die Interaktion von Metabolismus und Transport von PAK´s im humanen Darmepithel ist nicht auf die kanzerogenen Vertreter dieser Stoffklasse beschränkt, auch wenn Pyren, im Gegensatz zu zahlreichen kanzerogenen PAK´s, seinen Phase 1- und Phase 2- Metabolismus nicht induziert. Die Unterschiede zwischen den von Caco-2-Zellen nach apikal und basolateral transportierten Pyren-1-Sulfatmengen sind jedoch geringer als die für Benzo[a]pyren-1- und –3-Sulfat ermittelten. Diese werden in ähnlichen Versuchsansätzen weit vollständiger nach apikal abgegeben (BÜSEN et al., 2002). Dies läßt auf eine geringere Affinität des/der apikalen Transportproteine für diesen Pyrenmetaboliten im Vergleich zu den in gleicher Weise konjugierten Metaboliten kanzerogener PAK´s wie Benzo[a]pyren schließen - anders betrachtet auf eine Anpassung im Sinne eines optimierten Schutzes des Körpers vor Kanzerogenen.

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Stumkat, Lutz: Interaktion zwischen Metabolismus und Transport von Pyren in Caco-2-Zellen als Modell der gastrointestinalen Barriere. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

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