Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Charakterisierung von zytotoxischen Pseudomonas aeruginosa "small colony variants" isoliert aus dem Respirationstrakt von Patienten mit Cystischer Fibrose

Jordan, Doris

Chronic respiratory infections with P. aeruginosa  are the main complications in the pathogenesis of cystic fibrosis (CF). Clinical isolates of P. aeruginosa form various morphotypes when grown on diagnostic solid media. For a long time there was a focus on mucoide phenotypes, until in 1999 small colony variants (SCVs) were associated with chronic infections of CF patients. Based on their slow growth these morphotypes are easily ignored in routine diagnostics, but they can be correlated with poor lung functions in the CF patients and enhanced antibiotic resistance. The role of the P. aeruginosa SCVs in the pathogenesis of chronic infections remains unclear. Detailed analyses may have influence on new therapeutic approaches against chronic P. aeruginosa infections. In previous studies with one representative strain of an autoaggregative subgroup of SCVs showed, that with both, transcriptome and proteome analysis, the SCV showed an upregulation of genes or proteins of the type III secretion system in comparison to the clonal wildtype (WT). The objective of this study was to characterize the functionality of this upregulation of type III secretion. Therefore, a cell culture model to detect type III-mediated cytotoxicity and a mouse model of acute pneumonia were used. Furthermore, one objective was to establish a model to detect type III-mediated virulence by using the nematode C. elegans. By complementation of the SCVs with the gene pvrR the function of this gene in the SCV phenotype was characterized. In cytotoxicity experiments with 15 clinical isolates (SCVs and clonal WT) it was found, that four SCVs showed increased cytotoxicity in comparison to their clonal WT. All four SCVs belonged to the subgroup of seven autoaggregative SCVs. Eight non-autoaggregative SCVs showed no cytotoxicity. So there was a significant correlation between the phenotype of autoaggregative SCVs and increased cytotoxicity. In vivo experiments with BALB/c mice showed, that increased cytotoxicity of SCVs could be correlated with increased mortality of mice in an acute model of pneumonia. In this model type III secretion was an important pathomechanism. Increased virulence also correlated with increased bacterial numbers in lung, liver and spleen. Hisopathological examinations showed that the localization of infection was different after infection with SCVs or wildtypes. By using a knock out mutant of the type III secretion regulator exsA type III secretion-dependent alterations could be found. In  the C. elegans model established it was possible to detect type III secretion-mediated virulence for the first time in this system. On the other hand a new screening model was created to detect various virulence factors. Thus, the SCVs, which were avirulent under standard assay conditions, also showed virulence in this new model. One part of this virulence was mediated by the increased type III secretion. Experiments to find out the development of the SCV phenotype were done by complementation of SCVs with pvrR as already described for other SCVs. Overexpression of this two-component-regulator led to a partial restoration of the wildtype phenotype in all SCVs that were used. But some SCV features, for example  the increased cytotoxicity, still remained. Thus, the development of the SCV phenotype is likely to be based on microevolutionar processes in the CF lung that includes several steps. The SCVs used in this study showed, that the previous assumption of reduced virulence of P. aeruginosa in chronic infections in the CF lung does not apply to all morphotypes. Furthermore the knowledge of the existence and the partially increased virulence – in part dependent on increased type III secretion – of SCVs may further the development of new therapies against P. aeruginosa in chronic infected patients.

In der Pathogenese der Cystischen Fibrose (CF) bewirken chronische respiratorische Infektionen mit P. aeruginosa die schwerwiegendste Komplikation. Klinische Isolate von  P. aeruginosa aus CF-Patienten bilden nach Wachstum auf diagnostischen Festmedien verschiedenartige Kolonieformen (klonale Morphotypen). Lange Zeit richtete sich der Fokus auf mukoide Phänotypen von P. aeruginosa, bis 1999 die small colony variants (SCVs) mit chronischen Infektionen von CF-Patienten in Verbindung gebracht werden konnten. Diese werden in der Routine-Diagnostik aufgrund ihrer geringen Größe leicht übersehen. Sie korrelieren aber mit einer besonders schlechten Lungenfunktion der CF-Patienten und erhöhter antibiotischen Resistenz. Ihre Rolle im Rahmen der Pathogenese der chronischen Infektion ist jedoch unklar. Deren Aufklärung könnte Einfluss auf neuartige Therapien zur Bekämpfung chronischer Infektionen mit P. aeruginosa haben. In vorangegangenen Studien konnte bei einem repräsentativen Vertreter einer autoaggregativen Subgruppe von SCVs festgestellt werden, dass sowohl auf Transkriptomebene als auch auf Proteomebene die SCV im Gegensatz zum klonalen Wildtyp (WT) Gene, bzw. Proteine des Typ III Sekretionssystems um ein Vielfaches hochreguliert hatte. In der vorliegenden Arbeit sollte die Funktionalität dieser erhöhten Expression von Typ III Sekretion charakterisiert werden. Dazu wurde ein Zellkultur-Modell zur Messung Typ III-bedingter Zytotoxizität und ein akutes Pneumonie-Mausmodell verwendet. Des Weiteren sollte versucht werden, mit Hilfe des Nematoden C. elegans ein Modell zu etablieren, in dem es möglich ist, Typ III-bedingte Virulenz zu detektieren. Durch Komplementation der SCVs mit dem Gen pvrR sollte dessen Bedeutung für den SCV-Phänotyp charakterisiert werden. Bei Zytotoxizitäts-Versuchen mit 15 klinischen Isolaten von SCVs und klonalen WT wurde festgestellt, dass vier SCVs gegenüber ihrem WT deutlich zytotoxischer waren. Alle vier SCVs gehörten in die Subgruppe von sieben autoaggregativen SCVs. Acht nicht-autoaggregative SCVs zeigten keine Zytotoxizität. Damit ergab sich eine signifikante Korrelation zwischen dem Phänotyp der autoaggregativen SCVs und erhöhter, Typ III-bedingter Zytotoxizität. In vivo Versuche mit BALB/c-Mäusen ergaben, dass die erhöhte Zytotoxizität der SCVs mit einer erhöhten Mortalität korrelierte, wobei auch hier die Typ III Sekretion als wichtiger Pathomechanismus eine Rolle spielte. Erhöhte Virulenz korrelierte zudem mit erhöhten Keimzahlen in Lunge, Leber und Milz. Histopathologische Untersuchungen ergaben unterschiedliche Lokalisationen der Infektion in der Lunge nach Infektion mit SCVs, bzw. den klonalen WT. Durch den Einsatz einer Mutante mit einem Knock-out im Regulator-Gen exsA der Typ III Sekretion konnten Typ III Sekretion-spezifische Veränderungen festgestellt werden. Die Etablierung eines neuen C. elegans-Modells brachte die Möglichkeit, erstmals Typ III Sekretion-vermittelte Virulenz unter diesen Bedingungen nachzuweisen und es wurde damit ein neues Screening-Modell geschaffen, mit dem es möglich ist, unterschiedlichste Virulenzmechanismen von P. aeruginosa zu detektieren. Die unter Standard-Bedingungen avirulenten SCVs zeigten in diesem neuen Modell ebenfalls Virulenz, die zu einem Teil auch auf der erhöhten Typ III Sekretion beruhte. Versuche, der Ursache des SCV-Phänotyps auf den Grund zu gehen, wurden mit Komplementation durch pvrR durchgeführt. Überexpression dieses Zwei-Komponenten-Regulators führte bei allen verwendeten SCVs zu einer teilweisen Wiederherstellung des WT-Phänotyps. Einige SCV-Eigenschaften, wie die erhöhte Zytotoxizität, blieben jedoch erhalten, was dafür spricht, dass die Entstehung des SCV-Phänotyps auf mikroevolutionären Prozessen in der stark selektiv wirkenden CF-Lunge beruht, die über mehrere Schritte ablaufen. Die hier beschriebenen SCVs zeigen deutlich, dass die bisher angenommene verminderte Virulenz von P. aeruginosa in chronisch infizierten CF-Lungen nicht für alle Morphotypen gilt. Letztendlich könnte das Wissen um die Existenz und die teilweise hohe Virulenz – nicht zuletzt durch stark erhöhte Typ III Sekretion bedingt – von SCVs die Entwicklung neuer Therapieansätze gegen chronisch infizierende P. aeruginosa vorantreiben.

Quote

Citation style:

Jordan, Doris: Charakterisierung von zytotoxischen Pseudomonas aeruginosa "small colony variants" isoliert aus dem Respirationstrakt von Patienten mit Cystischer Fibrose. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

Rights

Use and reproduction:
All rights reserved

Export