Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Modifizierte durchflusszytometrische Methode zum empfindlicheren Nachweis der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies neutrophiler Granulozyten in vitro

Mironova, Liliya

An improved technique is described providing a more sensitive qualitative as well as a more reliable and informative quantitative evaluation of the generation of reactive oxygen species (ROS) by neutrophils in vitro. A major drawback of presently practised flow cytometric ROS-measurements is the variable loss of considerable amounts of PMN during their activation on plastic. These variable cell losses provide unreliable results because it is unknown to which extend the residually measurable cells really represent the initial population to be tested. In order to largely avoid such cell losses our new technique monitors the reactivity of PMN in 96 well microtiter plates on an isotonic Percoll cushion of 100 µL per well (Percoll-test) instead of placing the cell directly on plastic. For evaluation of the Percoll-test most of the parameters investigated were achieved contemporarily by identical cell preparations and conditions –  usually within the same microtiter plate –  however placing the cells directly on plastic. Thus, the only differences in these comparative tests were the contact of PMN to either plastic or Percoll. Both types of ROS-tests included triplicates of 3 x 105 purified PMN in 50 µL Dulbecco`s modified Eagle`s medium (DMEM) alone, with the addition of Dihydrorhodamine 123 (DHR), a green fluorescing indicator (FL1) of intracellular ROS-production, in a final concentration of 0,75 µg/mL with or without 1 to 10.000 nmol/L of phorbol-12-myristat-13-acetate (PMA), a receptor independent activator of cells. All tests were incubated for 45 min. at 37°C in 5% CO2 in air and stopped by placing them on wet ice (4°C). Prior to flowcytometric evaluation the addition of a defined amount of red fluorescing (FL4) CyTM5-labelled mononuclear reference cells permitted quantitation of the harvested PMN. Addition of the infra red fluorescing (FL4) dye To-Pro-3 allowed evaluation of cell viability. These comparative investigations were mainly performed with PMN purified from the peripheral blood of various healthy cows. They provided a number of surprising results: About 50% of the PMN incubated on plastic without any addition were lost for evaluation within 45 min. of incubation at 37°C. Stimulation of these cells by 10 to 10.000 nmol/L of PMA increased PMN losses to more than 80 and 95% of the input. Due to the fact that the residually harvested cells comprised an increasing number of “dead” (To-Pro-3 positive) cells (9% without and up to 30 % with PMA) the remarkable cell losses might be caused by cell death in addition to strong adherence to plastic. An additional loss factor is most likely the polystyrene tubes usually employed for flow cytometry (FACS tubes). Simple storage of none activated PMN for 40 min. at 4°C in these tubes can cause a considerable cell loss. This can be reduced or avoided by using polypropylene tubes instead plus measuring the cells in the flow cytometer immediately after harvest from the well into the tube. Identical treatment of PMN on a 100 µL Percoll-cushion per well instead on plastic reduced cell losses to a maximum of 5% of the input when incubated with or without up to 100 nmol/L of PMA. More than 100 nmol/L of PMA increased cell losses but hardly above 20%. Moreover the cell viability of the stock PMN preparation (< 2% “dead” cells) will not change during 45 min. of incubation with and without up to 10.000 nmol/L of PMA. The reduction of PMN losses achieved by the Percoll-cushion could by no means be reached by any of the 5 different brands of commercial microtiter plates tested. Also the functional differences were remarkable between plastic or Percoll incubated PMN: Plain incubation of PMN on plastic without any addition resulted in an increase in cell size plus an induction of ROS-production (by means of DHR fluorescence) by factors between 14 and 27 as compared to the stock suspension of PMN. In contrast to plastic Percoll did neither increase cell morphology nor did it induce ROS-production by more than 2. These results indicate an unpredictable costimulatory influence of the plastic surface on PMN. This view is supported by the results achieved in the presence of PMA as cell activator: On plastic a minimum concentration of 100 nmol/L of PMA was required to induce a clearly detectable ROS-production and only 1.000 or 10.000 nmol/L of PMA were able to achieve a plateau level of ROS. On Percoll, however, the same PMN responded 10 to 100 times more sensitive to PMA: With 10 nmol/L of PMA a strong ROS-production could be reliably documented and 100 nmol/L of PMA was enough to generate the plateau level of ROS which was frequently clearly above the plateau on plastic. In addition to improved sensitivity the range of reactivity was considerable wider on Percoll as compared to plastic: PMN stimulated with 10 nmol/L of PMA diplayed a ROS-production which was 373 – 634 times that of the same cells under identical conditions but without PMA. And with 100 nmol/L of PMA even factors of 914 – 1.080 were achieved. These were remarkable higher than those on plastic and with higher concentration of PMA: 1.000 to 10.000 nmol/L of PMA resulted only in factors of 45 – 63. As 30 to 100 nmol/L of PMA are sufficient to induce maximal ROS-production in PMN on Percoll these concentrations stay below those were cell losses on Percoll might exceed 5%. Thus, ROS studies on Percoll can be performed without any PMN loss greater than 5 % for most of the species tested. This new technique has been shown to be basically applicable to cattle as well as to dogs, humans and horses. It also made possible to document that 0,1 up to 100 autologous platelets have no detectable influence on the PMA induced ROS-production of PMN. In contrast, 50 % of autologous MNC reduce the ROS-production of PMN due to absorption of PMA and perhaps also by means of regulatory influence.

In der vorliegenden Arbeit wird eine verbesserte Technik vorgestellt, die nicht nur eine empfindlichere qualitative, sondern auch eine zuverlässigere und aussagekräftigere quantitative Auswertung der Bildung von reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) neutrophiler Granulozyten (PMN) in vitro ermöglicht. In den bisher eingesetzten durchflusszytometrischen Verfahren besteht der größte Nachteil in den stark variablen und teils sehr hohen Zellverlusten während der Aktivierungsphase der PMN in Reaktionsgefäßen aus Plastik. Diese variablen Zellverluste bieten ein unzuverlässiges Ergebnis, da sie die Frage offen lassen, wie repräsentativ die auswertbaren restlichen Zellen für die eingesetzte Gesamtzellpopulation sind. Um diese Verluste weitgehend zu vermeiden, wird in dem hier entwickelten neuen Verfahren die Reaktion der PMN in einer Zellkulturmikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen auf einem isotonen Percoll-Kissen von 100 µL/ Vertiefung (Percoll-Test) statt wie bisher auf der Plastikoberfläche geprüft. Zur Bewertung des Percoll-Tests wurden die meisten Parameter vergleichend an identischen Zellpräparationen zeitgleich – und meist in denselben Mikrotiterplatten – direkt auf Plastik (ohne Percoll-Kissen) jedoch unter sonst gleichen Bedingungen durchgeführt (Plastik-Test). In diesen Vergleichsuntersuchungen waren somit die einzigen Unterschiede der Kontakt der Zellen mit der Plastikoberfläche oder mit dem isotonen Percoll. In beide ROS Testarten wurden stets Triplikate von 3 x 105 gereinigter PMN in 50 µL Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium (DMEM) alleine, unter Zusatz des Fluoreszenzfarbstoffes Dihydrorhodamin 123 (DHR) – als grünfluoreszierender (FL1) Indikator der intrazellulären ROS-Produktion - in einer Endkonzentration von 0,75 µg/mL sowie ohne oder mit dem rezeptorunabhängigen Zellaktivator Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) in Endkonzentrationen von 1 bis 10.000 nmol/L eingesetzt. Beide Testarten wurden für 45 Min. bei 37 °C und 5% CO2 in Luft inkubiert und die Reaktion durch Lagerung auf feuchtem Eis (4°C) angehalten. Durch Zugabe einer definierten Anzahl CyÔ5-markierter (rotfluoreszierender: FL4) mononukleärer Referenzzellen wurde eine Quantifizierung der geernteten PMN möglich. Der Zusatz des tief rot fluoreszierenden (FL4) Farbstoffes To-Pro-3 erlaubte eine Beurteilung der Vitalität der PMN. Diese vergleichenden Untersuchungen, primär mit gereinigten PMN aus dem Blut gesunder Rinder durchgeführt, brachten eine Reihe überraschender Ergebnisse: Werden PMN ohne jeden Zusatz für 45 Min. bei 37°C auf Plastik inkubiert, so gehen allein dadurch ca. 50 % der Zellen für die Auswertung verloren. Werden sie zusätzlich noch mit 10 bis 10.000 nmol/L PMA stimuliert, betragen die Verluste über 80 bis 95 %. Da die gewonnen und im Durchflusszytometer auswertbaren „restlichen“ PMN auch zunehmend Anteile an „toten“ (To-Pro-3 positiven) Zellen (9% ohne PMA bis 30% mit PMA) zeigen, dürften die drastischen Verluste sowohl auf Plastikadhärenz als auch auf Zelltod beruhen. Dazu mag noch beitragen, dass in den üblichen Röhrchen zur durchflusszytometrischen Auswertung (FACS-Röhrchen) aus Polystyrol selbst nicht aktivierte PMN während 40 Min. Lagerung bei 4°C in beachtlichen Mengen verloren gehen. Diese Verluste lassen sich jedoch durch Polypropylenröhrchen und direkte Messung nach der Zellentnahme aus der Mikrotiterplatte weitgehend reduzieren. Werden die gleichen PMN statt auf Plastik auf einem isotonen Percoll-Kissen von 100 µL/Vertiefung jedoch sonst identisch behandelt, so treten ohne und mit bis zu 100 nmol/L PMA maximal 5% PMN-Verluste auf und selbst bei Zugabe von 10.000 nmol/L PMA erreichen die Verluste höchstens 20% der eingesetzten Zellmenge. Zudem ist gegenüber der Vitalität der Ausgangspopulation (< 2% „tote“ PMN) auch nach 45 Min auf Percoll ohne und mit bis 10.000 nmol/L PMA keine Änderung zu sehen. Die durch Percoll erzielte Vermeidung oder starke Reduktion der PMN-Verluste ließ sich durch keine der hier geprüften 5 unterschiedlichen kommerziellen Mikrotiterplatten auch nur annähernd erreichen. Funktionell unterschieden sich PMN ebenfalls erheblich, wenn sie direkt auf Plastik oder auf Percoll inkubiert wurden: Die alleinige Inkubation von PMN auf Plastik ohne jeden weiteren Zusatz führte zu einer Zunahme der Zellgröße und einer Induktion der ROS-Produktion (gemessen an der Intensität der DHR-Fluoreszenz) um den Faktor 14 bis 27 im Vergleich zur Ausgangspopulation. Im Gegensatz dazu wurde die Morphologie der PMN durch Percoll nicht vergrößert und ihre ROS-Aktivität war lediglich 2 x die der Ausgangspopulation. Diese Ergebnisse sprachen dafür, dass Plastik alleine einen unkontrollierbaren Einfluss auf die PMN hatte, der sich neben den Zellverlusten als Costimulator mit unbekannter Auswirkung bemerkbar machen konnte. Dafür sprachen auch die Ergebnisse unter Zusatz von PMA als Zellaktivator: Während auf Plastik erst ab 100 nmol/L PMA eine deutliche ROS-Produktion nachweisbar und ein Plateau erst bei 1.000 bis 10.000 nmol/L PMA erreicht wurde, reagierten die gleichen PMN auf Percoll um den Faktor 10 bis 100 x empfindlicher: Ab 10 nmol/L PMA war bereits eine starke ROS-Produktion zu messen, die meist schon bei 100 nmol/L PMA ihr Plateau erreichte, das häufig deutlich über dem des vergleichbaren Plastik-Tests lag. Neben der Empfindlichkeit war auch die Reaktionsbreite auf Percoll (bei 10 nmol/L PMA: 373 – 634 x und bei 100 nmol/L PMA: 914 – 1.080 x die ROS-Produktion der Kontrolle ohne PMA) wesentlich höher als auf Plastik (bei 100 nmol/L PMA: 8 – 10 x und bei 1.000 – 10.000 nmol/L PMA: 45 – 63 x). Da auf Percoll bereits mit 100 nmol/L PMA das Stimulationsplateau erreicht war, der PMA-Konzentration, bei der auch auf Percoll die Zellverluste über 5% stiegen, war eine nahezu verlustfreie Bestimmung der ROS-Produktion von PMN in vitro dank des Percoll-Kissens und dem hier beschriebenen Verfahren möglich. Prinzipiell ähnlich vorteilhaft erwies sich dieses neue Verfahren auch bei Hund, Mensch und Pferd. Zudem ermöglichte es den Nachweis, dass autologe Thrombozyten im Verhältnis 0,1 bis 100 pro PMN keinen erkennbaren Einfluss auf die ROS-Produktion nach PMA-Stimulation hatten. Deutlich anders war es bei 50% autologen MNC, die vermutlich durch Absorption von PMA als auch möglicherweise durch regulativen Einfluss die ROS-Produktion von PMN minderten.

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Mironova, Liliya: Modifizierte durchflusszytometrische Methode zum empfindlicheren Nachweis der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies neutrophiler Granulozyten in vitro. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

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