Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Rekombinationsanalyse des NK-Genkomplexes der Ratte und Entwicklung kongen-rekombinanter Stämme

Raber, Kerstin Alexandra

The natural killer gene complex (NKC) is a cluster of genes encoding several families of NK receptors with a C-type lectin structure (Nkrp1, Ly49, Cd94, Nkg2a/c, and Nkg2d). It is located on RNO4. The expression of the different NK receptor types and their functional interplay largely determine specificity and function of NK cell populations. Strain dependent differences in NK cell reactivity are likely to result from genetic polymorphisms of these receptors. For the analysis of their role in the pathophysiology of complex immunological disease models, it is important to be able to clarify the contribution of NKC subregions or individual NKC genes. Congenic animals possessing genetically polymorphic haplotypes on an identical genetic background and intra-NKC recombinant strains may be useful experimental tools for this purpose. The aim of this study was to develop and characterise such experimental systems in the rat. The previously generated congenic strain LEW.NKC(BS) carrying the NKC of strain BS on the LEW background was studied by serological methods (flow cytometry), RFLP analysis using probes for various established NK receptor genes and newly identified microsatellites. With this set of tools a recombination analysis was performed in a backcross population of 193 LEW.NKC(BS) x F1(LEW.NKC(BS) x LEW) animals. In this study two intra-NKC recombinants (NKCr1 and NKCr2) were identified and used to establish two new recombinant congenic strains, LEW.NKCR1 and LEW.NKCR2. In combination with the parental NKC haplotypes of strains LEW and LEW.NKC(BS), NKCr1 and NKCr2 represent models for the analysis of three distinct NKC subregions: (1) a centromeric subregion between Nkrp1a and the recombination break point of NKCr2 located between Nkg2a and D4Won4, (2) a subregion containing the centromeric part of the Ly49-cluster (Ly49 subregion I), and (3) the telomeric part of the Ly49 region (Ly49 subregion II). The recombination breakpoint of NKCr1 defines the border between Ly49 subregion I and II. The gene encoding a new NK receptor encoded by the NKC of LEW but previously not precisely mapped within the NKC could now be localised in the Ly49 subregion I. Furthermore, 22 additional recombination events were identified and mapped within the chromosomal region between A2m and Nkrp1a adjacent to the centromeric side of the NKC proper. Based on the available data on the physical size of the two regions and the recombination events found in this study the recombination frequencies are remarkably different with 3 recombinations/Mb for the A2m - Nkrp1a interval versus 0.6 recombinations/Mb for the NKC proper. This indicated recombination suppression for the NKC, fitting in with corresponding data for the mouse NKC showing recombination suppression for the subregion between Nkrp1a and Cd94. A further part of the study dealt with the analysis of seven additional NKC haplotypes present in other inbred strains. Using the microsatellites generated for the comparison of LEW and LEW.NKC(BS) additional insight into genetic variability of NKC haplotypes in the rat was obtained. The described genetic studies provide a basis for future functional studies of the relevance of polymorphic NKC differences in functional tests and in the analysis of immunological disease models.

Der NK-Genkomplex auf RNO4 kodiert für verschiedene NK-Rezeptorfamilien mit C-Typ-Lektinstruktur (Nkrp1, Ly49, Cd94, Nkg2a/c und Nkg2d). Die Expression dieser verschiedenen Rezeptortypen und deren Interaktion bestimmen zu einem grossen Teil die Spezifität und die Funktion von NK-Zell-Populationen. Stammspezifische Unterschiede der NK-Zell-Reaktivität dürften in erheblichem Umfang auf genetischen Polymorphismen der beteiligten Rezeptoren beruhen. Ein Weg zur Klärung der Rolle solcher Polymorphismen in der Pathophysiologie komplexer immunologischer Krankheitsmodelle besteht darin, die Beteiligung verschiedener NKC-Subregionen oder einzelner NKC-Gene an diesen Effekten aufzuklären. Dazu können kongene Stämme, die sich nur in genetisch polymorphen NKC-Haplotypen unterscheiden, und Stämme mit einem intra-NKC-rekombinanten Haplotyp einen wesentlichen Beitrag leisten. Das Ziel dieser Arbeit war die Etablierung und die Charakterisierung eines solchen Versuchssystems in der Ratte. Der in der Arbeitsgruppe entwickelte kongene Stamm LEW.NKC(BS), der den NKC des Stammes BS auf dem genetischen Hintergrund von LEW trägt, wurde mit serologischen Methoden (Durchflusszytometrie), RFLP-Analysen mit Sonden für verschiedene bekannte NKC Gene und neu generierten Mikrosatellitenmarkern untersucht und mit LEW verglichen. Mit diesen Methoden wurde dann in einer Rückkreuzungspopulation von 193 LEW.NKC(BS) x F1(LEW.NKC(BS) x LEW)-Tieren eine Rekombinationsanalyse durchgeführt. Es wurden zwei intra-NKC-Rekombinanten identifiziert (NKCr1 und NKCr2) und daraus zwei neue rekombinant-kongene Stämme entwickelt, LEW.NKCR1 und LEW.NKCR2. Gemeinsam mit den NKC-Haplotypen der Parentalstämme LEW und LEW.NKC(BS) stellen die beiden Intra-NKC-Rekombinanten ein System dar, um drei verschiedene NKC-Subregionen zu analysieren: 1. eine centromere Subregion zwischen Nkrp1a und dem Rekombinationspunkt von NKCr2, der zwischen Nkg2a und dem Mikrosatelliten D4Won4 liegt, 2. eine Subregion, die den centromeren Anteil des Ly49-Genclusters enthält (Ly49-Subregion I) und 3. den telomeren Anteil der Ly49-Region (Ly49-Subregion II). Die Grenze zwischen Ly49-Subregion I und II wird durch den Rekombinationspunkt von NKCr1 definiert. Das Gen für einen bisher nicht klassifizierten NK-Rezeptor, der bisher nur allgemein in den NKC kartiert werden konnte, wurde mit den rekombinanten Stämmen jetzt präziser in der Ly49-Subregion I lokalisiert. In der gleichen Rückkreuzungspopulation wurden in der chromosomalen Region zwischen A2m und Nkrp1a, die auf der centromeren Seite an den NKC anschliesst, 22 weitere Rekombinationsereignisse gefunden. Die relativen Rekombinationsfrequenzen differieren mit 3 Rekombinationen/Mb für das A2m-Nkrp1a-Intervall und mit 0,6 Rekombinationen/Mb für den NKC deutlich voneinander. Dies wies auf eine deutliche Rekombinationssuppression innerhalb des NKC hin und korrespondierte mit Daten für den NKC der Maus, der Rekombinationssuppression in der Subregion zwischen Nkrp1a und Cd94 zeigte. Ein weiterer Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Analyse von sieben weiteren NKC-Haplotypen anderer Standardinzuchtstämme. Die Analyse mit den neu generierten Mikrosatelliten gab zusätzliche Einsichten in die Variabilität von NKC-Haplotypen und deren Subregionen in der Spezies Ratte. Die genetischen Analysen dieser Arbeit schaffen eine verbesserte Basis für eine funktionelle Charakterisierung von NK-Zell-Funktionen in immunologischen Krankheitsmodellen.

Vorschau

Zitieren

Zitierform:

Raber, Kerstin Alexandra: Rekombinationsanalyse des NK-Genkomplexes der Ratte und Entwicklung kongen-rekombinanter Stämme. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

Rechte

Nutzung und Vervielfältigung:
Alle Rechte vorbehalten

Export