Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Chromatinstabilität und In-vitro-Kapazitationsparameter bei konservierten Eberspermien

Volker, Gabriele

In the first part of this study, the sperm-chromatin stability of a population of boars was evaluated by using the modified fluorescence microscopical Sperm Chromatin Structure Assay (mf-SCSA), which was developed in this institute. The following results were obtained:   §    It is necessary to maintain an environmental temperature of lower than 25 °C while preparing the smears. §    A mean of 3.3% (± 3.1%) spermatozoa per ejaculate were chromatin-unstable (177 ejaculates, 134 boars). §    90% of the ejaculates showed less than 5% chromatin-unstable spermatozoa. §    Boars, whose ejaculates contained more than 5% of chromatin-unstable spermatozoa (n=16 boars) were tested again. In the second test, only 31.3% of these boars had more than 5% chromatin-unstable spermatozoa per ejaculate. After up to 3 ejaculates of these boars had been tested, it was observed that the variation of the red value in the chromatin-stable sperm population was lower than the rate of chromatin-unstable spermatozoa. §    The percentage of chromatin-unstable spermatozoa correlated significantly (p≤0.05; R=0.38) with the rate of morphologically abnormal forms (n=16 boars, 27 ejaculates). §    The head abnormalities, as observed under the difference interference contrast microscope, of the chromatin-unstable population were compared with those of the chromatin-stable population (n=16 ejaculates; 11 boars). There were significantly more tapered spermatozoa (p≤0.05), significantly more spermatozoa with one crater (p≤0.05) and highly significantly more spermatozoa with more than one crater (p<0.001) in the chromatin-unstable population.   The mf-SCSA offers the opportunity to characterize boar sperm in a way that supplements conventional parameters of sperm quality.   In the second part of this study, parameters of in vitro capacitation were measured with a flowcytometer to test two things. Firstly, the relationship from ejaculates stored under standard conditions to conventional parameters of sperm quality was calculated. Secondly, the influence of storage and temperature on the plasma membrane stability was evaluated by observing parameters of in vitro capacitation. Six ejaculates from five boars were examined to evaluate plasma membrane destabilization caused by storage and temperature. Each ejaculate was pre-diluted 1:1 with BTS (32°C) and then divided into two portions. One portion was then diluted with BTS at 20°C, while the other was diluted with BTS at 32°C. These diluted ejaculates were again divided, each into four portions. Two portions of each were placed at 10°C for 24 h and 72 h, while the other two portions were placed at 16 °C for 24 h and 72 h. Using a kinetic method, parameters of in vitro capacitation were measured at 4 intervals of incubation time. The following results were obtained:   §    After 120 minutes of capacitational incubation, parameters of in vitro capacitation showed significantly negative correlation (p≤0.05) with morphologically abnormal forms (R=-0.38; R=-0.41) and with plasmatic droplets (R=-0.31; R=-0.32) (n=56 ejaculates, 18 boars). §    Using conventional parameters of sperm quality, no sperm-damage due to storage and temperature was observed. §    Both the storage temperature and the diluent temperature significantly influenced (p≤0.05) the percentage of high-calcium sperm within the population with an intact plasma membrane. The influx of calcium began earlier in sperm stored at 10°C. §    The storage temperature significantly influenced (p≤0.05) the percentage of acrosome-reacted sperm within the population with an intact plasma membrane. The acrosome reaction began earlier in sperm stored at 10°C.   Storing sperm at 10°C impaired plasma membrane stability, independent of storage time. The diluent temperature seemed to have only minor effects on the in vitro capacitation parameters.

Im ersten Teil dieser Arbeit wurde mit dem in diesem Institut modifizierten fluoreszenzmikroskopischen Spermienchromatinstruktur-Assay (mf-SCSA) die Chromatinstabilität in einer Eberpopulation untersucht. Folgende Ergebnisse wurden erhoben: §    Bei der Bearbeitung der Ausstriche muss die Umgebungstemperatur unter 25 °C gehalten werden. §    3,3 % (± 3,1 %) der Spermien pro Ejakulat waren durchschnittlich chromatininstabil (177 Ejakulate, 134 Eber). §    90 % der Ejakulate hatten weniger als 5 % chromatininstabile Spemien. §    Ejakulate von Ebern mit über 5 % chromatininstabilen Spermien (n=16 Eber) wurden wiederholt getestet. Im zweiten Test hatten nur 31,3 % dieser Eber mehr als 5 % chromatininstabile Spermien pro Ejakulat. Bei Untersuchung von bis zu 3 Ejakulaten dieser Eber waren Schwankungen im Rotwert der chromatinstabilen Spermienpopulation geringer als im prozentualen Anteil chromatininstabiler Spermien. §    Der Anteil chromatininstabiler Spermien (%) korrelierte signifikant (p≤0,05; R=0,38) mit dem Anteil morphologisch abweichender Spermien (%) (16 Eber, 27 Ejakulate). §    Mit dem Differenz-Interferenz-Kontrast-Mikroskop erfasste Kopfanomalien der chromatininstabilen Population wurden mit denen der chromatinstabilen Population verglichen (n=16 Ejakulate, 11 Eber). Es waren signifikant mehr Spermien verjüngt (p≤0,05), signifikant mehr Spermien mit einem Krater (p≤0,05) und hochsignifikant mehr Spermien mit mehr als einem Krater (p<0,001) in der chromatininstabilen Population.   Der mf-SCSA bietet die Möglichkeit, Eberspermien ergänzend zur Standardspermatologie zu charakterisieren.   Im zweiten Teil der Arbeit wurden In-vitro-Kapazitationsparameter flowzytometrisch gemessen. Zuerst wurden diese an standardmäßig gelagerten Ejakulaten erfasst und deren Beziehung zu standardspermatologischen Parametern geprüft. Danach wurden lagerungs- und temperaturbedingte Einflüsse auf die Plasmamembran-stabilität durch Bestimmung der In-vitro-Kapazitationsparameter ermittelt. 6 Ejakulate von 5 Ebern wurden zur Prüfung einer lagerungs- und temperaturbedingten Plasma-membrandestabilisierung untersucht. Jedes Ejakulat wurde nach 1:1 Vorverdünnung mit BTS (32 °C) in zwei Portionen aufgeteilt. Eine Portion wurde mit 20 °C warmen, die andere 32 °C warmen BTS endverdünnt. Diese endverdünnten Ejakulate wurden in jeweils 4 Portionen aufgeteilt und jeweils zwei davon bei 10 °C für 24 h und 72 h gelagert, während die anderen bei 16 °C für 24 h und 72 h gelagert wurden. Die Messungen erfolgten kinetisch zu 4 Inkubationszeitpunkten. Folgende Ergebnisse wurden erhoben: §    Nach 120 Minuten Kapazitationsinkubation korrelierten die In-vitro-Kapazitations-parameter signifikant (p≤0,05) negativ mit morphologisch abweichenden Spermien (%)(R=-0,38; R=-0,41) und mit Plasmatropfen (R=-0,31; R=-0,32) (n=56 Ejakulate, 18 Eber). §    Anhand der standardspermatologischen Parameter konnten keine lagerungs- und temperaturbedingten Spermienschäden festgestellt werden. §    Der Prozentanteil von Spermien mit erhöhtem intrazellulären Ca2+-Gehalt wurde signifikant (p≤0,05) von der Lagertemperatur und der Verdünnertemperatur beeinflusst. Der Calciumioneninflux begann bei 10 °C gelagerten Spermien früher. §    Der prozentuale Anteil akrosomreagierter Spermien der plasmamembranintakten Population wurde signifikant (p≤0,05) durch die Lagertemperatur beeinflusst. Die Akrosomreaktion begann bei 10 °C gelagerten Spermien früher.   Die Lagerung des Samens bei 10 °C führte zu einer Beeinträchtigung der Plasmamembranstabilität, welche unabhängig von der Lagerungsdauer war. Die Verdünnertemperatur schien nur geringe Auswirkungen auf In-vitro-Kapazitationsparameter zu haben.

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Volker, Gabriele: Chromatinstabilität und In-vitro-Kapazitationsparameter bei konservierten Eberspermien. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

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