Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Expression und Charakterisierung dreier IgG-Isotypen des Pferdes und Entwicklung eines monoklonalen Nachweisantikörpers für das equine IgG2

Wege, Anja Kathrin

IgG isotypes mediate different effector functions during the immune response. Until the early 1970th, studies on equine IgG isotypes characterized five IgG subclasses in horse serum (van der Scheer et al. 1940, Rockey et al. 1963 & 1967). The molecular analysis of equine immunoglobulin heavy chain constant genes identified seven IGHG genes in the horse genome (Wagner et al. 1998, 2002b & 2004). Most probably all IGHG genes of the horse can be expressed.   Three of these IgG-isotypes (IgG1 (formerly designated as IgGa), IgG3 (IgG(T)), and IgG4 (IgGb) have been expressed in equi-murine hetero-hybridomas obtained by fusion of equine lymphocytes with mouse myeloma cells. Specific antibodies have been generated for all three IgG isotypes and for IgM, IgGc, IgA and IgE. Thus far, no direct evidence was found for the expression of the IgG-isotypes (IgG2, IgG5 and IgG6). In consequence, no isotype specific reagents could be generated and the functional properties of these IgG isotypes during immune responses are still unknown.   In order to express the missing equine IgG isotypes we used an mammalian expression system to produce stable transfected cell lines which express recombinant IgG2, IgG5 and IgG6 with specificity for 4-(hydroxy-3-nitro-phenyl)acetyl (NP). To obtain cDNA of the horse IGHG2, IGHG5 and IGHG6 genes, RNA was isolated from equine lymphocytes, cDNA was generated by first strand reverse transcriptase reaction and the required IGHG genes were amplified by PCR using appropriate primers. The equine IGHG genes were cloned into a previously described derivate of the mammalian expression vector pcDNA3.1(-)/Myc-His containing the murine VH186.2 gene encode for the variable heavy chain domain. The lambda light chain secreting mouse myeloma cell line J558L was transfected with the equine IGHG2, IGHG5 and IGHG6 expression vectors and stable cell lines were established, expressing the three NP-specific IgG isotypes. Because of the known specificity (NP), these purified IgG antibodies can be used for functional investigation of free as well as of immuncomplexed antibodies to get more information about their functional properties during equine immune responses. The recombinant IgG2, IgG5 and IgG6 were characterized by SDS-PAGE and Western blotting and were further characterized using already available monoclonal antibodies to equine immunoglobulins. That way, IgG6 could be linked to the former IgGc subclass. IgG5 was recognized by anti-IgG(T) antibodies, indicating that the earlier IgG(T) subclass indeed represents two different equine IgG isotypes (Sheoran & Holmes 1996, Wagner et al. 2002b). IgG2 could not be detected with any of the available antibodies.   To generate anti-IgG2 antibodies, the purified recombinant IgG2 was used to immunize mices and the murine spleen cells were fused with murine x63-Ag8.653 myeloma cells (Kearney et al. 1979). Different monoclonal antibodies were obtained, tested and cloned by limiting dilution to obtain stable monoclonal cell lines, which produced specific anti-IgG2 antibodies. A cell line producing anti-IgG2 antibodies could be established. The antibodies were characterized by imunoblotting and ELISA and detected the recombinant as well as the native equine IgG2. Because of its relative molecular weight, the IgG2 seemed to form dimers and most probaly represent the former identified “aggregating immunoglobulin”in horse serum (Zolla & Goodman 1964). The recombinant IgG`s and the anti-IgG2 antibody can be used for further investigations to obtain more information about their functions during equine immune response.

Für das Verständnis der Funktionsweise des Immunsystems des Pferdes ist das Wissen über Vorkommen und funktionelle Bedeutung der einzelnen IgG-Isotypen mit entscheidend. Mehrere Forschungsgruppen beschäftigten sich bereits bis 1970 mit der Isolierung und Charakterisierung der einzelnen IgG-Isotypen aus dem Pferdeserum (van der Scheer et al. 1940, Rockey et al. 1964 & 1970) und konnten fünf verschiedene Subklassen isolieren. Anhand von molekularbiologischen Untersuchungen der Gene für die konstante Region der schweren Immunglobulinketten konnten sieben verschiedene IGHG Gene beim Pferd nachgewiesen werden (Wagner et al. 1998, 2002b & 2004). Vermutlich werden alle IGHG Gene, die bislang beim Pferd gefunden wurden, auch exprimiert.   Drei IGHG Gene (IgG1 (bislang als IgGa bezeichnet), IgG3 (IgG(T) und IgG4 (IgGb), wurden bereits von equi-murinen Heterohybridomen exprimiert, die durch Fusion von equinen Lymphozyten mit murinen Myelomzellen entstanden sind. Für diese drei IgG-Isotypen und für das equine IgM, IgGc, IgA und IgE sind monoklonale Nachweisantikörper verfügbar. Die drei IGHG Gene IGHG2, IGHG5 und IGHG6 konnten bislang nicht in reiner Form aus dem Serum gewonnen werden oder in Zelllinien hergestellt werden. Auch sind nicht für alle IgG-Isotypen entsprechende Nachweisantikörper verfügbar.   Daher wurden im Rahmen dieser Doktorarbeit mit Hilfe molekularbiologischer, zellbiologischer und serologischer Methoden die drei IgG-Isotypen IgG2, IgG5 und IgG6 des Pferdes in einem eukaryontischen Expressionsystem mit einer definierten Haptenspezifität für 4-hydroxy-3-nitro-phenyl-acetyl (NP) exprimiert. Dazu wurde die cDNA für das entsprechende Gen des konstanten Teils der schweren Kette (IGHG2, IGHG5 und IGHG6) mittels PCR amplifiziert und in einen Expressionsvektor kloniert, der bereits die genetische Information für die variable Region der schweren Ketten (murines VH186.2 Gen) enthielt. Eine Maus-Myelomzelllinie (J558L) wurde dann mit diesem Expressionsvektor transfiziert. Die J558L Zellen produzierten murine leichte Ketten, die mit der variablen Domäne aus dem verwendeten Expressionsvektor die Antigenbindungsstelle bildeten. Der für die Sekundärfunktion entscheidende und den Isotyp bestimmende konstante Teil der schweren Ketten stammte dagegen vom Pferd. Die transfizierten Zellen produzierten somit haptenspezifische (NP) equi-murine Antikörper mit dem funktionellen Fc-Anteil des entsprechenden equinen Ig Isotypen. Die NP-Spezifität diente dabei dem Nachweis und der Aufreinigung der exprimierten Proteine. Die rekombinanten Immunglobuline wurden anschließend im ELISA und Immunoblot weiter untersucht.   Für die weitere Charakterisierung der rekombinanten Immunglobuline (IgG2, IgG5 & IgG6) wurden die bereits verfügbaren monoklonalen Antikörper gegen equine IgG-Isotypen eingesetzt. Dabei zeigte sich, dass der als IgGc bezeichnete Isotyp dem IgG6 entspricht, d.h. vom IGHG6 Gen kodiert wird. Anti-IgG(T) Antikörper erkannten nicht nur IgG3 sondern auch den rekombinanten IgG5 Antikörper und bestätigten damit die bereits veröffentlichte Annahme (Sheoran & Holmes 1996, Wagner et al. 2002b), dass die IgG(T) Fraktion aus zwei unterschiedlichen Isotypen zusammengesetzt ist.   Da keine Nachweisreagenzien für das equine IgG2 gefunden werden konnte, wurde das rekombinante IgG2 zur Immunisierung von Mäusen eingesetzt um spezifische monoklonale Antikörper herzustellen. Dazu wurden nach der Fusion der Maus-Milzzellen mit murinen x63-Ag8.653 Myelomzellen (Kearney et al. 1979) die entstandenen Hybridome auf ihre Spezifität für das rekombinante IgG2 untersucht. Eine Zelllinie, die rIgG2-spezifische monoklonale Antikörper produzierte, wurde etabliert und die monoklonalen Antikörper wurden im ELISA und im Immunoblot auf ihre Spezifität für natives equines IgG2 getestet. Durch die Untersuchung verschiedener Pferdeseren konnte gezeigt werden, dass der anti-IgG2 Antikörper nicht nur das rekombinante Immunglobulin erkennt, sondern auch an Immunglobuline aus dem Serum bindet. Die im Serum nachgewiesenen IgG2 Immunglobuline sind aufgrund ihrer molekularen Größe vermutlich identisch mit dem IgG-Isotypen, der in frühen Studien als „aggregating immunoglobulin“ bezeichnet wurde (Zolla & Goodman 1968). Die hergestellten monoklonalen anti-IgG2 Antikörper sowie die haptenspezifischen, rekombinanten IgG-Isotypen sind für zahlreiche Testsystem wie zum Beispiel für den ELISA, durchflußzytometrische Analysen als auch funktionelle Untersuchungen einsetzbar und bieten damit die Möglichkeit, weitere grundlegende Erkenntnisse über die funktionelle Bedeutung der sieben unterschiedlichen IgG-Isotypen beim Pferd zu erhalten.

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Wege, Anja Kathrin: Expression und Charakterisierung dreier IgG-Isotypen des Pferdes und Entwicklung eines monoklonalen Nachweisantikörpers für das equine IgG2. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

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