Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Studien zur Bedeutung des Neuralen Zelladhäsionsmoleküls und der Polysialinsäure in der Entstehung von Valproinsäure-induzierten Neuralrohrdefekten

Hoffmann, Katrin

Valproic acid (2-n-propyl-pentanoic acid, VPA) is a single branched, short chain fatty acid. VPA is one of the most commonly used antiepileptic drugs worldwide with a broad efficiency against partial and generalised seizures in adults as well as in children. Additionally VPA is widely used in migraine prophylactics and against bipolar disorders. Currently a new development is the utilise of VPA in fighting cancer, this potency is already clinically used against childhood malignant glioma. Against this great therapeutical benefits of VPA are standing two severe, side effects: a life threatening, idiosyncratic hepatotoxicity and the teratogenicity. In men the spina bifida aperta is the only major malformation caused by the teratogenic effects of VPA. The incidence of spina bifida aperta is 10- to 20-times higher in new-borns after VPA-exposition compared to the average population. The exencephaliemodel allows the targeted induction of cranial neural tube defects in the NMRI-mouse by application of VPA on embryonic day 8.25. The chemical structure of the VPA-molecule was modified and gave insights into close structure-activity-relationships, but the reasons for the teratogenicity in-vivo still remained unknown. One potential target-structure of the described teratogenic effects is the Neural Cell Adhesion Molecule (NCAM). This protein is expressed in adults on the surface of neural cells and it mediates adhesive interactions between the cells. Polysialic acid (PSA) is the unique posttranslational modification of NCAM. This modification reverts the adhesive properties of NCAM; the distance between the cells is increased and the cells lose connection. PSA-NCAM is also titled as embryonic NCAM, because NCAM is  highly polysialylated during embryonic development. In adults this carbohydrate modification becomes reduced to a few restricted areas in the brain. Two polysialic acid-transferases are responsible for the poly-sialylation of NCAM; named ST8SiaIV and ST8SiaII. These enzymes are expressed in a different spatial and temporal pattern in embryonic and adult organisms. This thesis follows the question, if the polysialylation of NCAM could be a factor in the VPA-related teratogenesis in-vivo. This study shows, that the ST8SiaIV-knockout mouse is the suitable tool to investigate the introduced question. To characterise the model, the embryonic development of the ST8SiaIV-deficient mouse was described. The somites of embryos in different stages were counted, to gain information about the rates of development of the knockouts compared to wildtype- and NMRI-mice. It is shown, that the knockout of ST8SiaIV or the different genetic background has no influence on the rates of development within the investigated period. The following immunochemical detection of PSA and NCAM at different embryonic stages proved, that PSA-synthesis is delayed in the ST8SiaIV-deficient mouse compared to the wildtype controls. The first demonstration of PSA-synthesis was successfully carried out on day 9.0 of development compared to day 8.5 in the control animals; but the delayed synthesis of PSA did not cause any malformations in the knockout mice. The expression of the involved target-genes was quantitatively investigated with RT-PCR. This study showed, that the knockouts as well as the wildtype mice express ST8SiaII and NCAM with a slow increase during the period of neural tube closure. The wildtype animals showed a sharp increase in ST8SiaIV expression between day 8 and 9 of embryonic development. The genetic background of the ST8SiaIV-knockout mice is partly based on the C57BL6/J strain, therefore one part of this thesis worked out the influence of the genetic background on the teratogenic effects of VPA and of the highly-teratogenic derivative S-pentyl-4-pentinoic- acid. This thesis showed, that the C57BL6/J inbred strain is three- to fourfold less susceptible compared to the Hsd:Win NMRI outbred strain. The investigation was carried out comparably to the rates of embryonic development of the two mouse-strains, to guarantee the treatment in the exencephalie model during the same sensible periods of neural tube development. Based on own studies it was found out, that in case off a treatment of the ST8SiaIV-knockout mouse within the exencephaliemodel the compound would enter an embryonic organism with only PSA-free NCAM. The embryonic development within the same rates like the Hsd:Win NMRI-mouse means a treatment of the same sensible period of cranial neural tube closure. Using the highly teratogenic VPA-derivative S-pentyl-4-pentinoic acid, it could be shown, that the ST8SiaIV-knockout mouse develops significantly less exencephalic-malformations after treatment than wildtype-control mice. The deficiency of ST8SiaIV, and therefore the loss of PSA during the sensible period of neural tube closure, caused a significantly reduced rate of exencephaly. By detecting S-pentyl-4-pentinoic acid-levels in brain tissue and plasma it was documented, that the compound was removed from the maternal organism before PSA-synthesis started. The expression of the target genes on mRNA-level showed, that NCAM-expression is not increased but decreased or not influenced in the whole embryo. ST8SiaIV expression was decreased after treatment, while ST8SiaII was not influenced. In order to test VPA effects in a less complex system, VPA and derivatives were used in a rat hippocampal cell model. The substances were able to induce dose-dependent differentiation of foetal rat hippocampus-cells. The observed differentiation corresponded to the teratogenic potencies of the drugs. However, because the neuritogenesis was induced in the presence and absence of PSA, this system could not be set in correlation to the observed in-vivo effects. This study presents for the first time the polysialylation of the Neural Cell Adhesion Molecule as a functional target in S-pentyl-4-pentinoic acid-induced neural tube defects. Questions concerning the details of the underlying molecular mechanisms need further experimental work.

Die Valproinsäure (2-n-Propyl-Pentansäure, VPA) ist eine kurzkettige, einfach verzweigte Fettsäure. VPA ist weltweit eines der am häufigsten eingesetzten Antiepileptika; das Einsatzgebiet ist ausgesprochen vielfältig und erstreckt sich über generalisierte und partielle Krampfanfälle sowohl bei Erwachsenen als auch bei Kindern. Ein weiteres großes Einsatzgebiet der VPA ist die Migräneprophylaxe und die Behandlung manisch-depressiver Erkrankungen. Eine aktuelle Entwicklung im vielfältigen therapeutischen Einsatz der VPA ist die anti-kanzerogene Wirkung, die bereits klinisch in der Bekämpfung maligner Gliome bei Kindern genutzt wird. Dem großen therapeutischen Potential stehen allerdings zwei schwere Nebenwirkungen gegenüber: eine idiosynkratische Hepatotoxizität und die Teratogenität. Die teratogenen Effekte der Valproinsäure verursachen beim Menschen als einzige schwere Fehlbildung die Spina bifida aperta. Die Häufigkeit dieses Defektes ist bei Neugeborenen nach VPA-Exposition 10- 20mal höher als im Bevölkerungsdurchschnitt. Das Exenzephaliemodell in der NMRI-Maus erlaubt es, durch Injektion von VPA an Tag 8,25 der Embryonalentwicklung gezielt VPA-induzierte craniale Neuralrohrdefekte zu erzeugen. Durch die Modifikation des VPA-Moleküls konnten enge Struktur-Aktivitätsbeziehungen aufgestellt werden; die Ursachen dieser Teratogenität sind in-vivo dennoch weitgehend unbekannt. Eine mögliche Zielstruktur der teratogenen Effekte ist das Neurale Zelladhäsionsmolekül (NCAM). Dieses Protein wird im adulten Organismus an der Oberfläche von Nervenzellen exprimiert und vermittelt adhäsive Wechselwirkungen zwischen den Zellen. NCAM besitzt eine einzigartige posttranslationale Modifikation, die Polysialinsäure (PSA). Die Modifikation des NCAM mit PSA kehrt die adhäsiven Eigenschaften um, der Abstand zwischen den Zellen wird vergrößert, und die Nervenzellen verlieren an Zusammenhalt. PSA-NCAM wird auch als embryonale Form des NCAM bezeichnet, da während der Entwicklung das NCAM zum größten Teil polysialyliert vorliegt, und im adulten Organismus diese Modifikation bis auf einige begrenzte Bereiche des Gehirns wieder verloren geht. Für die Polysialylierung sind die zwei Polysialyltransferasen ST8SiaII und ST8SiaIV verantwortlich, die im embryonalen und adulten Organismus in unterschiedlicher Weise exprimiert werden. Die Arbeit folgte der Zielsetzung, die Polysialylierung des NCAM in-vivo als Faktor in der Teratogenese der VPA  zu untersuchen.  Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, die ST8SiaIV-knockout Maus im Exenzephaliemodell als passendes Instrument zur Bearbeitung der vorgestellte Fragestellung zu identifizieren. Hierzu wurde die Embryonalentwicklung der ST8SiaIV-knockout Maus im Zeitraum des Neuralrohrschlusses charakterisiert. Die Geschwindigkeit der frühen Embryonalentwicklung wurde vergleichend zu NMRI- und zu ST8SiaIV(+/+) Mäusen anhand der Anzahl der Somitenpaare in verschiedenen Entwicklungsstadien ermittelt. Diese Untersuchungen zeigten, dass der Verlust der ST8SiaIV oder der genetische Hintergrund keine verzögerte Entwicklung im Vergleich zur NMRI-Maus zur Folge hat. Der immunhistochemische Nachweis der PSA und des NCAM in den Embryonen der knockout-Mäuse zeigte jedoch, dass die Tiere durch den Verlust der ST8SiaIV die PSA verzögert synthetisieren; der erste Nachweis gelang am Tag 9,0 der Entwicklung im Vergleich zu Tag 8,5 bei den Konntrolltieren. Die verzögerte Synthese führte jedoch nicht zu Defekten während der Entwicklung. Die Expression der beteiligten Zielgene wurde quantitativ mit Hilfe der RT-PCR Technik untersucht. Diese Untersuchung zeigte, dass sowohl die knockout- wie auch die Kontrolltiere ST8SiaII und NCAM im Zeitraum des Neuralrohrschlusses mit langsamer Steigerung exprimieren. Die ST8SiaIV zeigte in den Kontrolltieren einen sprunghaften Anstieg zwischen Tag 8 und 9 der Entwicklung. Die ST8SiaIV-knockouts basieren teilweise auf dem genetischen Hintergrund der C57BL/6J Maus, daher beschäftigte sich ein Teil der Arbeit mit dem Einfluß des genetischen Hintergrundes auf die teratogenen Effekte der VPA und des hochteratogenen VPA-Derivates S-Pentyl-4-Pentinsäure (S-Pentyl-4-yn). Diese Studie zeigte, dass die C57BL/6J Maus 3-4fach weniger empfindlich war als die NMRI Maus. Diese Untersuchung wurde vergleichend zur Geschwindigkeit der Embryonalentwicklung der zwei Mäusestämme durchgeführt, um die Behandlung der Tiere während der gleichen sensiblen Phase der Neuralrohrentwicklung sicherzustellen. Auf Grundlage eigener Untersuchungen wurde festgestellt, dass bei einer Nutzung der ST8SiaIV-knockout Maus im Exenzephaliemodell der Wirkstoff auf einen embryonalen Organismus mit ausschließlich nicht-polysialyliertem NCAM traf.  Die Entwicklung in gleicher Geschwindigkeit der NMRI-Maus bedeutete im Exenzephaliemodell die Beeinflussung der gleichen sensiblen Phase des cranialen Neuralrohrschlusses. Durch die Anwendung des hochteratogenen VPA-Derivates S-Pentyl-4-yn konnte gezeigt werden, dass die ST8SiaIV-knockout Maus signifikant weniger Exenzephalien durch die Behandlung entwickelt als die Kontrolltiere. Der Knockout der ST8SiaIV -und dadurch der Verlust der PSA im sensiblen Zeitraum der Entwicklung- hatte eine deutlich verringerte Fehlbildungsrate zur Folge. Durch die Untersuchung der Plasma- und Gehirnkonzentrationen des S-Pentyl-4-yn wurde dokumentiert, dass der Wirkstoff aus dem Organismus entfernt war, bevor die Synthese der PSA im STSiaIV-knockout Embryo begann. Die Untersuchung der Behandlungseffekte auf mRNA-Ebene mit der RT-PCR Technik zeigten, dass NCAM nicht verstärkt, sondern verringert oder unbeeinflußt im Gesamtembryo exprimiert wird. Die ST8SiaIV wurde verringert exprimiert, während die ST8SiaII keine Reaktion auf die Behandlung zeigte. Zur Fokussierung auf die einzelne Zelle wurde ein in-vitro System verwendet. Die eingesetzten VPA-Derivate zeigten analog zu ihrer Teratogenität eine dosisabhängige, differenzierende Wirkung auf fetale Hippocampuszellen. Die induzierte verstärkte Neuritogenese stand jedoch nicht in einem funktionellen Zusammenhang mit der Polysialylierung des NCAM an der Oberfläche der Zellen, was durch einen enzymatischen Abbau des Zuckers gezeigt wurde. Die Arbeit präsentiert erstmals die Polysialylierung des NCAM als funktionelle Zielstruktur in S-Pentyl4-Pentinsäure-induzierten Neuralrohrdefekten. Die Frage nach den molekularen Zusammenhängen und der Rolle des NCAM in diesem Prozess bleibt offen, und die Bearbeitung erscheint als spannendes Ziel weiterer Untersuchungen.

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Hoffmann, Katrin: Studien zur Bedeutung des Neuralen Zelladhäsionsmoleküls und der Polysialinsäure in der Entstehung von Valproinsäure-induzierten Neuralrohrdefekten. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

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