Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Etablierung immunzytologischer Techniken zur Charakterisierung von Tumoren des Hundes und deren diagnostische Relevanz bei der Erkennung von Tumormetastasen in Lymphknoten sowie exfoliierter Tumorzellen in Körperhöhlenergüssen

Höinghaus, Ruth

The aim of this study was to establish immunocytological diagnostics of canine proliferations and metastases with antibodies to human proteins. Immunocytological investigations were made of 181 epithelial and 108 mesenchymal proliferations, 37 organmetastases as well as 31 effusions into body cavities in 280 dogs, presented for surgical biopsy, tumor extirpation or euthanasia at the Clinic of small animals, School of Veterinary Medicine Hannover. From dogs with a malignant epithelial tumor 161 lymph nodes were collected for comparative cytological and immunocytological detection of metastases. The immunocytological investigations were carried out using broad spectrum anticytokeratins AE1/AE3 and KL1, monoklonal antibodies to specific cytokeratins (CK7, CK8, CK18, CK14; CK20) and Vimentin, Desmin, Melan-A, S100, Lysozym and vWF. Adaption of each antibody on cytological specimen was done after determination of the optimal antibody dilution. All epithelial proliferations and their metastases stained distinct positive using broad spectrum anticytokeratin AE1/AE3, whereas after immunocytological staining using broad spectrum anticytokeratin KL1 less reliable results were observed. Many of the KL1-negative proliferations were of columnar epithelial origin. Most of the tumors of squamous epithelial origin showed KL1-positive reaction. Similar to humans, proliferations from ductal, glandular and urothelial epithelia as well as their metastases stained positive for specific antibody CK7. In contrast to humans, in a great part of canine proliferations of intestinal epithelia CK7-positive staining was observed. Canine epithelial tumors of the stomach and the intestine reacted distinct positive using the monoclonal antibody to CK20, which is a typical cytokeratin in gastrointestinal epithelia of human beings. Canine tumors of squamous epithelia (including their metastases) and adnexal structures stained - in conformity to humans - CK14-positive, a cytokeratin specific for epidermal epithelia, while staining for CK7 was negative in most of the cases. All canine proliferations of mesenchymal origin were AE1/AE3-negative and distinctly positive for the antibody against vimentin. Similar to results in humans, epithelial proliferations of the dog (mamma, stomach, squamous epithelia, thyroidea, prostate) showed positive reaction using vimentin. In the present study, vimentin coexpression was also observed in canine gastrointestinal benign and malignant tumors, which was not observed in human beings. Differentiation of canine epithelial and mesenchymal proliferations was possible by immuncytological stainings using the antibody combination AE1/AE3 and vimentin. All canine benign and malignant melanomas showed S100-positive reaction. With the exception of two undifferentiated malignant melanomas, positive Melan-A staining was observed as well. The specificity of S100 and Melan-A was assessed in canine tumors and tissues of non-melanocytic origin. Conforming to the results in human beings, S100 showed lower specificity than Melan-A. In all cytological specimens from canine tumors of smooth and striated muscle origin, desmin-positive staining results were observed. The assessment of the specificity for desmin in tumors and tissues of non-muscle origin showed only negative staining results. Positive reaction was observed in all endothelial tumors and metastases with antibody to vWF. The specificity of vWF was testet in tissues and tumors of no endothelial origin and – with the exception of two mammary carcinomas – all samples stained vWF-negative. Proliferations of histiocytic origin including histiocytoma and malignant histiocytosis stained positive for lysozym. All tested tumors and tissues of no histiocytic origin did not react with lysozym. In 13 body cavity effusions from dogs without neoplastic disease – similar to observations in humans – constant expression of cytokeratin, vimentin and desmin was found in reactive mesothelial cells. This coexpression was also observed in exfoliated mesothelioma cells in three effusions of dogs with malignant mesothelioma. In twelve effusions from dogs with malignant epithelial tumor differentiation of exfoliated carcinoma cells from mesothelial cells could be made by the absence of desmin expression in the carcinoma cells. A vimentin coexpression in exfoliated carcinoma cells was observed in six cases. The sensitivity of immunocytological detection of lymph node metastases from epithelial tumors using the broad spectrum anticytokeratin AE1/AE3 was significantly higher in three of four investigators than the cytological investigation (0,99 vs. 0,88; 0,92 vs. 0,80 und 0,90 vs. 0,70 [p<0,05], fourth investigator: 0,96 vs. 0,90). The global comparison for the four investigators demonstrated higher immunocytological sensitivity in detection of lymph node metastases (p=0,0030). Especially micrometastases were detected based on immunocytological techniques which were not found in conventionally stained cytologic specimens. The negative predictive value was constantly higher for immunocytological investigation as well. Different results were observed for the specificity and the positive predictive value which were significantly lower for the two unexperienced investigators (p<0,05). The sensitivity of immunocytological investigation (by the author) of 50 lymph nodes prepared by fine needle aspiration was higher than cytological results (p=0,0104). The immunocytological results of the detection of  lymph node metastases indicate that this technique carried out by an experienced investigator is an useful and reliable diagnostic tool.

Die Ziele der vorliegenden Studie waren es, die immunzytologische Diagnostik caniner Tumoren und deren Metastasen mittels humaner Antikörper zu etablieren. Hierzu wurden insgesamt 181 epitheliale und 108 mesenchymale Tumoren sowie 37 Organmetastasen und 31 Körperhöhlenergüsse von 280 Hunden, die an der Klinik für kleine Haustiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover zur chirurgischen Biopsienahme, Tumorextirpation oder zur Euthanasie anstanden, immunzytologisch untersucht. Von Hunden, welche an einem epithelialen Tumor erkrankt waren, wurden zusätzlich 161 Lymphknoten entnommen und vergleichend zytologisch und immunzytologisch auf das Vorliegen von Metastasen untersucht. Untersuchungen erfolgten mit den Breitspektrumantizytokeratinen AE1/AE3 und KL1, Antikörpern gegen spezifische Zytokeratine (CK7; CK8, CK18, CK14, CK20), Vimentin, Desmin, Melan-A, S100, Lysozym und vWF, die jeweils - in optimalen Arbeitsverdünnungen - an zytologische Präparate etabliert wurden. Alle epithelialen Zubildungen und die davon ausgehenden Metastasen konnten mit deutlich positiver immunzytologischer Färbung mit dem Breitspektrumantizytokeratin AE1/AE3 detektiert werden, wo hingegen die immunzytologische Reaktion von KL1 weniger zuverlässige Ergebnisse lieferte, was sich besonders in einer Vielzahl von KL1-negativen Ergebnissen bei Zubildungen zylinderepithelialer Herkunft manifestierte. Tumoren plattenepithelialer Herkunft waren hingegen zumeist KL1-positiv. Analog zum Menschen konnten Proliferationen duktaler, glandulärer und urothelialer Herkunft sowie davon ausgehende Organmetastasen mit dem spezifischen Antikörper gegen CK7 immunzytologisch gefärbt werden. Bei Zubildungen der caninen intestinalen Epithelien konnten, im Gegensatz zum Menschen auch positive Reaktionen mit CK7 festgestellt werden. Die caninen Zubildungen des Magens und Darms sowie die davon ausgegangenen Organmetastasen wiesen deutlich positive Anfärbungen mit dem Antikörper gegen CK20 auf, was auch beim Menschen als typisches Zytokeratin der gastrointestinalen Epithelien gilt. Die caninen plattenepithelialen Proliferationen und deren Metastasen sowie Proliferationen der adnexalen Strukturen der Haut konnten, analog zum Menschen, mit dem Antikörper gegen das plattenepitheltypische CK14 immunzytologisch gefärbt werden, während die Reaktion mit CK7 in den meisten Fällen negativ verlief. Alle Zubildungen mesenchymaler Herkunft reagierten negativ mit dem Breitspektrumantizytokeratin AE1/AE3 und deutlich positiv mit dem Antikörper Vimentin. Darüber hinaus konnten in weitgehender Übereinstimmung zum Menschen in epithelialen Zubildungen des Hundes (Mamma, Magen, Plattenepithel, Schilddrüse, Prostata) positive Reaktionen mit Vimentin festgestellt werden. Diese Vimentinkoexpression in epithelialen Zubildungen des Hundes konnte in der vorliegenden Studie auch in benignen und malignen Proliferationen des Darms beobachtet werden, was so für den Menschen nicht beschrieben worden ist. Die Abgrenzung zwischen epithelialer und mesenchymaler Neoplasie konnte mittels der Kombination von AE1/AE3 und Vimentin geführt werden. Alle caninen benignen und malignen Melanome konnten mit S100 immunzytologisch gefärbt werden. Die Reaktion mit Melan-A war mit Ausnahme von zwei undifferenzierten malignen Melanomen ebenfalls positiv. Für die Antikörper S100 und Melan-A wurde an Normalgeweben und Tumoren des Hundes, welche nicht melanozytären Ursprungs waren eine Spezifitätsprüfung vorgenommen, in der sich S100 auch beim Hund im Vergleich zu Melan-A als weniger spezifisch. An zytologischen Präparaten von Tumoren der glatten und quergestreiften Muskulatur des Hundes konnte die Färbung mit Desmin ein typisches Intermediärfilament der muskulären Zellen adaptiert werden. Eine Spezifitätsprüfung an nicht muskulären caninen Normalgeweben und Tumoren ergab jeweils negative Reaktionen. Des Weiteren wurden zumeist deutlich positive Reaktivitäten in caninen Tumoren endothelialen Ursprungs und deren Metastasen mit dem Antikörper gegen vWF beobachtet. Die Überprüfung der Spezifität von vWF in zytologischen Präparaten von Normalgeweben und Tumoren des Hundes nicht endothelialer Herkunft zeigte - mit Ausnahme von zwei Mammakarzinomen - in keiner Probe positive Anfärbungen. Histiozytäre Proliferationen einschließlich benigner und maligner Tumoren histiozytären Ursprungs des Hundes zeigten in allen Fällen Lysozym-positive Reaktionen. Canine Normalgewebe und Tumoren nicht histiozytären Ursprungs waren in allen Fällen Lysozym-negativ. In den 13 Körperhöhlenergüsse mit reaktiven Mesothelzellen von Hunden ohne neoplastische Primärerkrankung konnte - analog zum Menschen - eine konstante Expression von Zytokeratin, Vimentin und Desmin festgestellt werden. Diese Dreifachexpression konnte auch in den drei Ergüssen von Hunden, welche an einem malignen Mesotheliom erkrankt waren, in den exfoliierten Mesotheliomzellen beobachtet werden. Die exfoliierten Karzinomzellen in den zwölf Körperhöhlenergüssen von Hunden mit maligner epithelialer Neoplasie unterschieden sich von Mesothelzellen in der fehlenden Expression von Desmin. Die Karzinomzellen zeigten neben der erwarteten Zytokeratinexpression in sechs Fällen eine Vimentinkoexpression. Die Sensitivität bezüglich der immunzytologischen Detektion von Lymphknotenmetastasen epithelialer Tumoren mit dem Breitspektrumantizytokeratin AE1/AE3 gefärbten Lymphknotenabklatschpräparaten lag bei 3 von 4 Untersuchern deutlich über der zytologischen Untersuchung (0,99 vs. 0,88, 0,92 vs. 0,80 und 0,90 vs. 0,70 [p< 0,05], 4. Untersucher: 0,96 vs. 0,90). Der globale Vergleich aller vier Untersucher zeigte eine sensitivere immunzytologische Detektion der Lymphknotenmetastasen (p=0,0300). Insbesondere konnten Mikrometastasierungen mittels immunzytologischer Technik nachgewiesen werden, welche in den konventionell zytologisch gefärbten Präparaten nicht erfasst wurden. Auch beim negativ prädiktiven Wert zeigten sich durchweg höhere Werte für die Immunzytologie. Allerdings war das Bild different bei Spezifität und positiv prädiktivem Wert, die bei den 2 Untersuchern mit geringer zytologischer Erfahrung unter den Verhältnissen der konventionellen zytologischen Diagnostik lagen (p< 0,05). Auch in den 50 Lymphknotenaspirationspräparaten, die nur von der Autorin untersucht wurden, konnte der immunzytologische Nachweis von Metastasen mit AE1/AE3 sensitiver als in der Zytologie geführt werden (p=0,0104). Die Ergebnisse der immunzytologischen Untersuchung von Lymphknoten im Hinblick auf das Vorliegen einer Metastasierung verdeutlichen, dass dieses Verfahren in der Hand eines erfahrenen Untersuchers einen aussagekräftigen und zuverlässigen Test darstellt.

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Höinghaus, Ruth: Etablierung immunzytologischer Techniken zur Charakterisierung von Tumoren des Hundes und deren diagnostische Relevanz bei der Erkennung von Tumormetastasen in Lymphknoten sowie exfoliierter Tumorzellen in Körperhöhlenergüssen. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

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