Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Optimierung und Anwendung einer Analysemethode zur selektiven und sensitiven Bestimmung von Folatmustern in klinischen Proben und Lebensmitteln

Kehlenbach, Ulla

Folates are essential for a variety of physiological processes in animals and humans and there has been increasing interest in recent years due to their potential in preventive medicine. One major limitation of folate research is the lack of suitable analytical methods for the determination of the vitamins. The use of reliable and preferably error-free methods, however, is a basic requirement for the correct interpretation of various studies.   Starting out from the method published by BELZ and NAU (1998) a highly selective technique for the sensitive measurement of folates in different matrices was established and further optimised with regard to robustness and sensitivity. The principle of the method is based on a direct coupling of an isocratic ion-pair HPLC for the separation of the folates and a microbiological assay employing L.casei for the detection of the separated analytes (HPLC/MA). With detection limits between 0.11 and 0.60 nmol/L for the different folate metabolites, the sensitivity of the HPLC/MA-methodology was comparable to those of chromatographic techniques employing a MS, or a fluorescence detector. The exceptional high selectivity of the L.casei detection allowed the interference-free determination of folate patterns in various matrices without the need of extensive sample clean-up procedures. As a result, a significant simplification of the sample pre-treatment was achieved and the potential for analyte losses was reduced. HPLC/fluorescence methods, which are frequently used in folate analysis and the steadily increasing number of HPLC/MS techniques are dependent on a reversed-phase chromatography with acidic eluents, leading to interconversions of some folate derivatives during the separation. Unlike those methods, the HPLC/MA-technique allowed a separation by using an ion-pair HPLC with a mobile phase of approximately neutral pH. In comparison with the reversed-phase methods, the HPLC/MA-system was thus able to provide further information on the native folate patterns of the analysed samples. The method was validated and found to be suitable for the intended purpose.   The application range of the HPLC/MA-coupling technique was extended to the area of food folate analysis by developing a very simple preparation method for food samples of animal and vegetable origin. Due to the high selectivity of the microbiological detection system, specific procedures for purifying sample extracts were no longer required. Analyses of different model foods, which had to be performed within an EU project, demonstrated that the established method was suitable for the interference-free and accurate determination of folate patterns in foodstuff of various sources.   Within the scope of this work, the established HPLC/MA-technique was further applied to the determination of folate patterns in human samples derived from different clinical trials. The aim of those studies was to investigate the influence of supplements containing the natural folate derivative 5-MTHF on the metabolism of healthy volunteers in comparison with the traditionally used folic acid, which practically does not occur in nature. It could be shown that the (6S)-5-MTHF supplementation increased plasma folate in healthy adults at least to a similar extent as equimolar amounts of folic acid. With regard to its effectiveness for a long-term increase of the erythrocyte folate levels (6S)-5-MTHF even had a significantly higher potential. Moreover it could be demonstrated that an every day intake of 400 µg folic acid – which corresponds to the recommended daily allowance for women of childbearing age – will possibly result in a permanent circulation of small amounts of that not naturally occurring folate in the plasma. Supplements of (6S)-5-MTHF, however, merely caused quantitative changes in the folate levels. Based upon the results of this work, (6S)-5-MTHF is a potential alternative to folic acid, at least for a use in vitamin supplements.   The HPLC/MA analyses of the whole-blood samples additionally showed that considerable differences regarding the erythrocyte folate pattern could be found in about 30% of the volunteers with the thermolabile MTHFR. These findings implied an impaired synthesis of 5-MTHF out of the other coenzyme forms during erythropoiesis. The erythrocyte thus appears to be a suitable, easy accessible sample matrix for indicating disturbances with regard to folate metabolism. The HPLC/MA data further suggest that besides the 677C®T MTHFR polymorphism, at least one additional factor had to be responsible for the detected alterations in folate metabolism. Further research is needed to find out the entire reasons for the different folate pattern and to answer the question whether those disturbances are of any clinical relevance.

Folate sind für eine Vielzahl physiologischer Prozesse von Mensch und Tier von grundlegender Bedeutung und haben in den letzten Jahren aufgrund ihres präventiv-medizinischen Potentials verstärktes Interesse gefunden. Eine der Hauptbeschränkungen der Folatforschung liegt in der analytischen Methodik zur Bestimmung der Folatvitamere. Die Verwendung zuverlässiger und möglichst fehlerfreier Analysemethoden ist jedoch eine grundlegende Voraussetzung dafür, daß aus Studiendaten korrekte Schlußfolgerungen gezogen werden.   Basierend auf der Methode von BELZ und NAU (1998) wurde im Rahmen dieser Arbeit zunächst ein hochselektives Verfahren zur empfindlichen Messung von Folaten in unterschiedlichen Matrizes etabliert und bezüglich seiner Robustheit und Sensitivität optimiert. Das Analyseprinzip der Methode beruhte auf der direkten Kopplung von einer isokratischen Ionenpaar-HPLC zur Trennung der Folate und einem mikrobiologischen Assayverfahren unter Anwendung des Organismus L.casei zur Detektion der getrennten Analyte (HPLC/MA). Mit Nachweisgrenzen zwischen 0,11 und 0,60 nmol/L für die verschiedenen Folatmetabolite war die Empfindlichkeit der HPLC/MA-Methodik vergleichbar mit denen von chromatographischen Verfahren unter Anwendung einer MS- oder Fluoreszenzdetektion. Die außergewöhnlich hohe Selektivität der L.casei-Detektion ermöglichte zudem die störungsfreie Bestimmung von Folatmustern in unterschiedlichsten Matrizes, ohne dass es spezieller Verfahren zur Aufreinigung der Probenextrakte bedurfte. Daraus resultierte eine erhebliche Vereinfachung der Probenaufarbeitung und das Risiko von Analytverlusten wurde reduziert. Die heutzutage in der Folatanalytik dominierenden HPLC/ Fluoreszenz-Methoden sowie die zunehmend aufkommenden HPLC/MS-Verfahren sind in der Regel auf eine reversed-phase Chromatographie unter Einsatz von sauren mobilen Phasen angewiesen, unter deren pH-Bedingungen es jedoch zu Interkonversionen einiger Folatderivate kommt. Im Gegensatz zu diesen Methoden erlaubte die HPLC/MA-Technik die Trennung der Folate unter Anwendung einer IP-Chromatographie mit einer mobilen Phase von annähernd neutralem pH-Wert. Im Vergleich zu den RP-Verfahren ermöglichte die HPLC/MA-Methode damit die Gewinnung weitergehender Informationen zum nativen Folatmuster in den analysierten Proben. Das Verfahren wurde für die zu untersuchenden Matrizes validiert und erwies sich als tauglich für die geplanten Einsatzzwecke.   Durch die Entwicklung einer sehr einfachen Methode zur Aufarbeitung von Lebensmittelproben tierischen und pflanzlichen Ursprungs ließ sich das Anwendungsgebiet der HPLC/MA-Kopplungstechnik auf diesen analytischen Bereich ausdehnen. Dabei erlaubte die hohe Selektivität der mikrobiologischen Detektion den Verzicht auf spezielle Verfahren zur Aufreinigung der Probenextrakte. Die im Rahmen eines EU-Projekts durchzuführenden Analysen von verschiedenen Modell-Lebensmitteln zeigten, dass die etablierte Methodik zur störungsfreien und präzisen Bestimmung von Folatmustern in Lebensmitteln unterschiedlichster Natur geeignet war.   Der weitere Anwendungsschwerpunkt im Rahmen dieser Arbeit lag in der Bestimmung der Folatmuster von klinischen Humanproben aus verschiedenen Interventionsstudien. Ziel dieser Studien war die Untersuchung des Einflusses von Supplementen des naturidentischen Folatmetaboliten 5-MTHF auf den Stoffwechsel von gesunden Probanden im Vergleich zu der üblicherweise eingesetzten Folsäure, welche in biologischen Materialien praktisch nicht vorkommt. Dabei ließ sich demonstrieren, dass durch die Einnahme von (6S)-5-MTHF-Supplementen die Plasmafolatspiegel von gesunden Erwachsenen mindestens ebenso effektiv gesteigert werden konnten wie mit äquimolaren Mengen an Folsäure. Bezüglich der Wirksamkeit zur langfristigen Erhöhung der Erythrozytenfolatlevel zeigte (6S)-5-MTHF sogar ein signifikant höheres Potential. Ferner konnte demonstriert werden, dass bei einer täglichen Einnahme von 400 µg Folsäure (= der für Frauen im schwangerschaftsfähigen Alter empfohlenen mittleren Tagesdosis) mit einer dauerhaften Zirkulation von geringen Mengen an diesem nicht natürlichen Folat im Plasma zu rechnen ist. (6S)-5-MTHF-Supplemente führten hingegen lediglich zu einer quantitativen Veränderung der Folatspiegel. Basierend auf den Ergebnissen dieser Arbeit stellt (6S)-5-MTHF – zumindest bezüglich eines Einsatzes in Vitaminsupplementen – eine potentielle Alternative zur Folsäure dar.   Im Rahmen der Vollblutanalysen konnte ferner festgestellt werden, dass etwa 30% der Probanden mit der thermolabilen Variante der MTHFR ein deutlich verändertes Erythrozytenfolatmuster besaßen. Dies ließ auf Störungen der Synthese von 5-MTHF aus den anderen Coenzymformen während der Erythropoese schließen. Der Erythrozyt scheint demnach ein geeignetes, einfach zugängliches Probenmaterial zu sein, um Störungen im Folatmetabolismus anzuzeigen. Die HPLC/MA-Daten deuteten darauf hin, dass neben dem 677C®T-MTHFR-Polymorphismus noch mindestens ein zusätzlicher Faktor für die nachgewiesenen Veränderungen im Folatstoffwechsel verantwortlich sein musste. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um die Ursachen für die abweichenden Folatmuster komplett zu ergründen und um zu klären, ob die Störungen im Folathaushalt von klinischer Relevanz sind.

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Kehlenbach, Ulla: Optimierung und Anwendung einer Analysemethode zur selektiven und sensitiven Bestimmung von Folatmustern in klinischen Proben und Lebensmitteln. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

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