Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Ex vivo examination of canine microglia in different intracranial diseases

Stein, Veronika Maria

Microglial cells are the main immune effector elements of the brain. They respond to virtually every kind of disruption of homeostasis in the CNS and rapidly progress from their resting, ramified state to an activated state where they can proliferate, migrate, express surface molecules de novo or at increased levels, and exert functions similar to those of macrophages such as phagocytosis and generation of ROS and NO. It has long been believed that microglial cells follow an uniform unspecific reaction pattern upon activation. Evidence has grown that this view seriously underrates microglial competence in the immune surveillance of the CNS.   The purpose of this study was to elucidate whether the canine microglial reaction pattern differs in response to different alterations in the CNS and whether the findings of our preliminary study on demyelination due to CDV infection were specific to a demyelinating disease or also apply to other disease entities. This would indicate that the canine microglial reaction is stereotypic. To our best knowledge, this study is the first comparative characterization of microglial cells ex vivo in different diseases.   Canine microglial cells from dogs suffering from different intracranial and extracranial diseases were characterized immunophenotypically and functionally ex vivo by flow cytometry. The dogs were divided into eight examination groups according to histopathological diagnosis. The results of each group were evaluated and compared to those of a preliminary study of the microglial ex vivo examination in dogs of a vaccine challenge experiment with canine distemper virus infection and demyelination in CNS.   In the vaccine challenge experiment, microglia of dogs with histopathologically confirmed demyelination due to CDV infection showed marked upregulation of the surface molecules CD18, CD11b, CD11c, CD1c, MHC class I, MHC class II, and a tendency for increased expression intensity of ICAM-1 (CD54), B7-1 (CD80), and B7-2 (CD86). Functionally, microglial cells in demyelination due to CDV were shown to have significantly enhanced phagocytosis and generation of ROS.   A tendency for an upregulated expression was found for various surface molecules on microglia in different CNS alterations. Statistical significance was found only in certain surface molecules: there was an upregulated expression of CD11b in dogs with intracranial tumors and inflammation; MHC II was also upregulated in dogs with intracranial inflammation, whereas upregulation of B7-1 and B7-2 was found only in dogs with demyelination. Functionally, phagocytosis was significantly enhanced in dogs with demyelination and in those with intracranial inflammation, but ROS generation was significantly enhanced only in dogs with demyelination.   In conclusion, it appears that microglial response to various diseases can be both stereotypic and specific. Our results point to a certain degree of conformity in the immunophenotypical response of microglia, whereas the functional response of canine microglia seems to differentiate between different underlying pathologies. Phagocytosis was found to be enhanced for inflammation and demyelination in the CNS, which therefore indicates a more specific microglial response. Significant enhancement of ROS generation was found only in dogs with demyelination and not in those with other diseases. This strongly suggests a specific response of microglia to demyelination and underscores the pivotal role of microglia in the pathogenesis of demyelination.   In contrast to findings regarding ROS generation, findings for the production of another endogenous gas, NO, seems to be stereotypic. In our study there were no enhanced levels of NO neither in microglial culture supernatant nor in CSF corresponding to a specific disease entity.

Mikrogliazellen sind die Immuneffektorzellen des zentralen Nervensystems (ZNS). Nahezu jede Störung der Homöostase im ZNS wie Infektion, Trauma, Ischämie, Degeneration und Demyelinisierung führt zu ihrer Aktivierung und somit zur Entfaltung ihres immunologischen Repertoires. Dieses umfasst eine Proliferation und Migration, eine Aufregulation oder de-novo-Expression von Oberflächenantigenen und die Ausübung typischer Makrophagen-Funktionen wie die Phagozytose und die Generation von reaktiven Sauerstoffmolekülen (ROS) oder Stickstoffmonoxid (NO). Die Aktivierung der Mikrogliazellen wurde lange Zeit als unspezifischer stereotyper Prozeß angesehen, der ungeachtet seiner zugrunde liegenden Ätiologie einheitlich abläuft. Ergebnisse unterschiedlicher Studien erhärten inzwischen den Verdacht, dass diese Betrachtung die immunologische Kompetenz der Mikroglia­zellen deutlich unterschätzt.   Zur Klärung der Frage, ob das Reaktionsmuster der Mikroglia auf unterschiedliche pathologische Stimuli tatsächlich einem stereotypen Schema folgt oder eine spezifische Antwort der Mikroglia resultiert, wurde sie bei Hunden, die an verschiedenen intrakraniellen Erkrankungen litten, untersucht. Unsere Studie stellt die erste vergleichende Untersuchung der Mikroglia ex vivo bei verschiedenen Erkrankungen des ZNS dar.   Die Hunde wurden auf der Grundlage der histopathologischen Diagnose in acht verschiedene Untersuchungsgruppen eingeteilt. Die Ergebnisse der immunphäno­typischen und funktionellen Charakterisierung der Mikroglia der einzelnen Gruppen wurde bewertet und zudem mit den Resultaten einer vorangegangenen Studie mit Hunden mit experimenteller Staupevirusinfektion verglichen.   Hunde mit staupetypischen Läsionen und Demyelinisierung im ZNS wiesen eine deutliche Aufregulation der Oberflächenmoleküle CD18, CD11b, CD11c, CD1c, MHC Klasse I und MHC Klasse II, sowie eine Tendenz für eine aufregulierte Intensität von ICAM-1 (CD54), B7-1 (CD80), und B7-2 (CD86) auf. Funktionell zeigte sich eine statistisch signifikant aufregulierte Phagozytose und ROS-Bildung. Eine Tendenz für eine aufregulierte Expression fand sich für mehrere Oberflächen­antigene bei verschiedenen ZNS-Alterationen. Eine statistische Signifikanz fand sich lediglich für die Aufregulation von CD11b bei Hunden mit intrakraniellen Tumoren und Entzündungen, die zudem eine Aufregulation von MHC II aufwiesen. Eine Aufregulation der Antigene B7-1 (CD80) und B7-1 (CD86) auf Mikroglia wurde lediglich bei Demyelinisierungen verursacht durch Staupevirusinfektion gefunden. Funktionell fiel eine statistisch signifikant verstärkte Phagozytose neben den Hunden mit Demyelinisierung auch bei Hunden mit intrakraniellen Entzündungen auf, wohingegen eine gesteigerte Bildung von ROS lediglich bei Hunden mit Demyelinisierung gefunden wurde. Diese war signifikant höher als bei allen anderen Untersuchungsgruppen.   Als Ergebnis scheint somit in Bezug auf den Immunphänotyp eine gewisse Einheitlichkeit im Reaktionsmuster der Mikroglia auf unterschiedliche pathogene Stimuli zu bestehen. Funktionell zeigt sich jedoch durch die signifikante Steigerung der Phagozytose bei Hunden mit Demyelinisierung und intrakraniellen Entzündungen eine Tendenz zu einer mehr spezifischen Antwort. Die signifikante Steigerung der ROS-Bildung im Vergleich zu allen anderen Untersuchungsgruppen weist jedoch sehr stark auf eine spezifische Reaktion der Mikroglia bei Demyelinisierungen hin, welche zudem ihre zentrale Rolle in der Pathogenese der Demyelinisierung unterstreicht.   Im Gegensatz zur spezifischen Bildung von ROS bei Läsionen im ZNS mit Demyelinisierung konnte bei der Untersuchung eines weiteren endogenen Gases, NO, keine Korrelation zu spezifischen intrakraniellen Erkrankungen gefunden werden. Daher scheint die Bildung von NO eine eher unspezifische Reaktion der Mikroglia bei verschiedenen Erkrankungen des zentralen Nervensystems zu sein.

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Stein, Veronika Maria: Ex vivo examination of canine microglia in different intracranial diseases. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

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