Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchung der Mechanismen von Pharmakoresistenz in verschiedenen Epilepsiemodellen

Volk, Holger

Epilepsy is the most common chronic neurological disease in humans and animals, such as dogs and cats. Pharmacotherapy is still the most important form of treatment. In spite of the variety of antiepileptic drugs in human and veterinary medicine, one third of patients with epilepsy are pharmacoresistant. Temporal lobe epilepsy is the most common form of epilepsy but also the form, which is most difficult to treat.  In pharmacoresistant patients with epilepsy surgical removal of the epileptic focus and the surrounding tissue provides the only option to obtain seizure control. The causes and the underlying mechanisms of pharmacoresistance are still unknown, so that there is a lack of rational approaches for the development of new therapeutic strategies. The widespread opinion is that the phenomenon of pharmacoresistance in treatment of epilepsy has multifactorial causes. An important characteristic of pharmacoresistant epilepsy is that most patients with refractory epilepsy are resistant to most, and often all, antiepileptic drugs. This argues against epilepsy-induced alterations of specific drug targets as a major cause of intractable epilepsy, and rather indicates non-specific or adaptive mechanisms playing a major role. Morphological alterations, such as gliosis and neurodegeneration, which are seen in hippocampal sclerosis, could be one possible cause of refractory epilepsy. Another likely cause of pharmacoresistant epilepsy could be that a local overexpression of multidrug transporters in the epileptic focus could limit brain access of antiepileptic drugs. The multidrug transporter P-glycoprotein seems to be the most important in the efflux transport of antiepileptic drugs in the blood-brain barrier.   For the development of new therapeutic strategies, it is important to know the underlying mechanisms leading to refractory epilepsy. Thus, we investigated, if the overexpression of P-glycoprotein is induced in different cell types by seizures or by a combination of seizure and subchronic treatment. Furthermore, it was explored, if pharmacoresistant rats show an overexpression of P-glycoprotein or morphological alterations, such as gliosis and neurodegeneration.   For immunohistochemical studies of P-glycoprotein expression three epilepsy models were used to investigate the influence of acute seizures. The animal models used were the amygdala-kindling model, in which seizures are induced by repeated electrical stimulations, and two epilepsy models, in which a status epilepticus (SE) was induced by treatment with a chemoconvulsant (SE-kainate model and SE-pilocarpine model). The SE-pilocarpine model with and without subchronical phenytoin treatment was used for immunohistochemical studies of P-glycoprotein localisation and expression.   The induction of an SE in rats can result in the development of spontaneous recurrent seizures after a latency period of some weeks (Post-SE model). Therefore, we induced a SE by either the chemoconvulsant pilocarpine or by prolonged electrical stimulation of the basolateral amygdala (BLA) to get epileptic rats. The epileptic rats of the post-SE-pilocarpine model or of the post-SE-BLA model were selected pharmacologically with levetiracetam or phenobarbital in pharmacosensitive (responder) and pharmacoresistant (nonresponder). Additionally, in the amygdala-kindling model responders and nonresponders were selected in repeated phenytoin drug trials. In an immunohistochemical study the nonresponders were compared with the responders to investigate if the nonresponders have an overexpression of p-glycoprotein or morphological alterations.   In the amygdala-kindling model, the status-epilepticus-kainate model, and the status-epilepticus-pilocarpine-model seizures have been shown to induce a transient overexpression of P-glycoprotein, which gives evidence that P-glycoprotein’s overexpression in human epilepsy patients is mainly due to uncontrolled seizures.  The rate of overexpression of P-glycoprotein was correlated with seizure severity and duration. Long lasting seizure activity caused an induction of P-glycoprotein expression in astrocytes and neurons; hence, the intracellular and extracellular distribution of the antiepileptic drug might be altered causing a decline of effect. In these animal experiments, P-glycoprotein expression was induced in all cell types which had been described to overexpress P-glycoprotein in humans with refractory epilepsy. Besides the fact that P-glycoprotein expression is not induced by antiepileptic drugs, we could not demonstrate an increase in overexpression of P-glycoprotein by combining seizure activity and treatment with an antiepileptic drug which argues against any induction of this transporter by such drugs.   Using three different epilepsy models with responders und nonresponders, the importance of P-glycoprotein in refractory epilepsy was further confirmed. A subgroup of pharmacoresistant kindled rats selected by the anticonvulsant effect of the antiepileptic drug phenytoin showed an overexpression of P-glycoprotein especially near by the electrode. Furthermore, epileptic rats not responding to phenobarbital treatment had a clear P-glycoprotein overexpression in regions, which are important for seizure development and progression. In contrast, epileptic rats, which did not respond to levetiracetam, did not indicate an overexpression of P-glycoprotein. This might be explained by the recent findings that levetiracetam, in contrast to phenobarbital and phenytoin, is not a substrate of P-glycoprotein.   Additionally, nonresponders showed in comparison with responders no difference in astrogliosis or neurodegeneration. Only epileptic rats not responding to treatment with phenobarbital had markedly less neurons. Interestingly the seizure frequency of those rats correlated negatively with the rate of neurodegeneration, possibly suggesting that persistence of some subtypes of neurons might lead to pharmacoresistance.   The results of the present study confirm that multidrug transporters play a role in refractory epilepsy and indicate that neurodegeneration might be important for the development of pharmacoresistant epilepsy. These findings might help to find new therapeutic strategies for the treatment of pharmacoresistant epilepsy.

Epilepsien sind die häufigsten chronischen neurologischen Erkrankungen des Menschen, aber auch der Hunde und Katzen. Die wichtigste Therapieform der Epilepsie ist nach wie vor die Pharmakotherapie. Ungeachtet der Anzahl von Antiepileptika in der Humanmedizin bzw. Tiermedizin werden noch immer ein Drittel der Patienten als pharmakoresistent eingestuft. Die Temporallappenepilepsie ist die am häufigsten vorkommende Epilepsieform beim Menschen, die zudem am schwierigsten medikamentös zu kontrollieren ist. Bei solchen Patienten ist die chirurgische Entfernung des epileptischen Fokus, also des Hippokampus und angrenzender Regionen oft die einzige Therapiemöglichkeit, um Anfallsfreiheit zu erreichen. Die Ursachen und die Mechanismen einer Pharmakoresistenz sind zur Zeit unbekannt, so dass es keine kausalen Ansätze zur Entwicklung neuer Antiepileptika mit besserer Wirkung gegen schwer behandelbare Epilepsien bei Tier und Mensch gibt. Es wird vermutet, dass es sich bei der Pharmakoresistenz um einen multifaktoriellen Prozess handelt. Interessanterweise sprechen pharmakoresistente Epilepsiepatienten auf eine Vielzahl von Antiepileptika unzureichend an, obwohl diese unterschiedliche Wirkungsmechanismen besitzen. Diese Tatsache spricht dafür, dass unspezifische Mechanismen an der Ausprägung der Pharmakoresistenz bei Epilepsien beteiligt sind. Bei der Pharmakoresistenz könnten morphologische Veränderungen, wie Gliose und Neurodegeneration, die unter anderem bei einer Hippokampus-Sklerose auftreten, eine Rolle spielen. In der Epilepsieforschung wird ferner seit einigen Jahren als mögliche Ursache der Pharmakoresistenz diskutiert, ob eine lokale Überexpression von Multidrug-Transportern im Bereich des epileptischen Fokus zu einer Limitierung der Aufnahme von Antiepileptika ins Gehirn führen kann. Dies könnte zur Folge haben, dass im Bereich des epileptischen Neuronennetzwerks eine unzureichende Antiepileptikakonzentration vorhanden ist, so dass Krampfaktivität weiterhin entstehen und sich ausbreiten kann. Der Multidrug-Transporter P-Glykoprotein scheint die größte Bedeutung bei einem auswärtsgerichteten Transport von verschiedenen Antiepileptika an der Blut-Hirn-Schranke zu besitzen.   Die Entwicklung neuer pharmakotherapeutischer Strategien und Antiepileptika, um eine Pharmakoresistenz zu vermeiden bzw. zu durchbrechen, erfordert Erkenntnisse über die einzelnen Faktoren, die zu einer Entstehung einer Pharmakoresistenz führen können. In der vorliegenden Arbeit wurde daher durch immunhistologische Methoden untersucht, ob die Expression von P-Glykoprotein in den verschiedenen Zelltypen des Gehirns durch unkontrollierte Anfälle bzw. durch Anfälle kombiniert mit einer gleichzeitigen chronischen Antiepileptika-Behandlung induziert werden kann. Ferner wurde immunhistologisch untersucht, ob pharmakoresistente Ratten eine Hochregulation der P-Glykoprotein-Expression bzw. morphologische Veränderungen, wie verstärkte Neurodegeneration bzw. Gliaaktivierung, aufweisen.   Für immunhistologische P-Glykoprotein-Lokalisation- und –Expressionsstudien wurden verschiedene tierexperimentelle Modelle für Epilepsie verwendet. Zur Untersuchung des Einflusses akuter Anfälle auf die P-Glykoprotein-Expression wurde das Amygdala-Kindling-Modell, bei dem durch wiederholt elektrische Stimulationen Anfälle ausgelöst werden, sowie zwei Epilepsie-Modelle, bei denen ein Status epilepticus (SE) durch Chemokonvulsiva (SE-Kainat-Modell oder SE-Pilocarpin-Modell) induziert wird, verwendet. Das SE-Pilocarpin-Modell wurde sowohl mit als auch ohne subchronische Phenytoin-Behandlung auf P-Glykoprotein-Lokalisation- und -Expression untersucht.   Nach einem SE tritt nach eine Latenzzeit von ein paar Wochen spontane epileptische Anfallsaktivität (Post-SE-Modell) auf. Durch Pilocarpin im SE-Pilocarpin-Modell und durch langanhaltende elektrische Stimulation im SE-Basolaterale-Amygdala-Modell wurde ein SE ausgelöst, um epileptische Ratten zu gewinnen. Im weiteren wurden die epileptischen Ratten aus dem Post-SE-Pilocarpin-Modell mit Levetiracetam bzw. aus dem Post-SE-Basolaterale-Amygdala-Modell mit Phenobarbital in pharmakosensitive (Responder) und pharmakoresistente (Nonresponder) Tiere selektiert. Ferner wurden Responder und Nonresponder im Amygdala-Kindling-Modell mit Phenytoinselektion gewonnen. Bei Nonrespondern wurde im Vergleich zu den Respondern immunhistologisch untersucht, ob erstere eine Hochregulation der P-Glykoprotein-Expression bzw. morphologische Veränderungen, wie verstärkte Neurodegeneration bzw. Gliaaktivierung, aufweisen.   In immunhistologischen P-Glykoprotein-Expressionsstudien konnte im Amygdala-Kindling-Modell und im Status-epilepticus-Kainat-Modell bzw. –Pilocarpin-Modell gezeigt werden, dass Krampfanfälle eine transiente Hochregulation der Expression des Multidrug-Transporters P-Glykoprotein auslösen. Dementsprechend könnte die Überexpression von P-Glykoprotein bei Epilepsiepatienten vorwiegend durch unkontrollierte Anfallsaktivität bedingt sein. Im Epilepsie-Modell war der Grad der Überexpression in Endothelzellen der Blut-Hirn-Schranke positiv korreliert mit der Anfallsschwere und –dauer. Nach langanhaltender Krampfaktivität konnte eine Induktion der P-Glykoprotein-Expression in Astrozyten und Neuronen detektiert werden, die im Gehirn einer unbehandelten Ratte keine nachweisbare P-Glykoprotein-Expression aufweisen. Funktionell könnte dies zu einer Beeinflussung des intra- und extrazellulären Verteilungsmusters von Antiepileptika führen und damit zu einer Reduktion deren Wirksamkeit beitragen. Es konnte somit tierexperimentell gezeigt werden, dass Krampfanfälle die Expression von P-Glykoprotein in allen Zelltypen induzieren kann, in denen eine Überexpression in epileptogenem Gehirngewebe von pharmakoresistenten Epilepsiepatienten gezeigt wurde. Neben dem schon früher gezeigten Fehlen einer Induktion der P-Glykoprotein-Expression durch Antiepileptika konnten ferner in der vorliegenden Arbeit nur schwache Hinweise gefunden werden, dass eine Antiepileptikatherapie mit dem Antiepileptikum Phenytoin die Induktion der P-Glykoprotein-Expression nach einem Anfall verstärkt.   Ein weiteres Argument für die Bedeutung von P-Glykoprotein für die Pharmakoresistenz von Epilepsien erhielten wir durch Untersuchungen in drei Epilepsie-Modellen an Respondern und Nonrespondern. Zum einen konnte bei gekindelten Nonrespondern, die anhand der antikonvulsiven Wirkung des Antiepileptikums Phenytoin selektiert worden waren, eine signifikant höhere P-Glykoprotein-Expression insbesondere im Bereich der elektrischen Stimulationselektrode gefunden werden. Zum anderen konnte bei epileptischen Ratten, die auf die Behandlung mit dem Antiepileptikum Phenobarbital nicht ansprachen, eine sehr deutliche Hochregulation der Expression von P-Glykoprotein in Gehirnregionen, die für die Krampfentstehung und –ausbreitung von Bedeutung sind, nachgewiesen werden. Bei epileptischen Ratten allerdings, die auf die Antiepileptikatherapie mit Levetiracetam nicht ansprachen, konnten keine Unterschiede hinsichtlich der P-Glykoprotein-Expressionsrate gefunden werden. Letzteres Ergebnis passt zu dem Befund der Arbeitsgruppe von Prof. Löscher, dass Levetiracetam im Gegensatz zu Phenobarbital oder Phenytoin auch kein Substrat des Multidrug-Transporters P-Glykoproteins zu sein scheint.   Desweiteren konnte bei den Respondern und Nonrespondern durch Untersuchungen auf Gliaaktivierung und Neurodegeneration keine Hinweise gefunden werden, dass diese eine Rolle bei der Entwicklung einer Pharmakoresistenz spielen könnten. Nur bei epileptischen Ratten, die auf die Behandlung mit Phenobarbital nicht ansprachen, konnte eine verstärkte Neurodegeneration festgestellt werden. Interessanterweise war die Anfallsfrequenz der Ratten dieser Subgruppe negativ korreliert mit dem Grad der Neurodegeneration. Dies könnte bedeuten, dass die Persistenz bestimmter Subgruppen von Neuronen die Entwicklung einer Pharmakoresistenz begünstigt.   Die anhand von tierexperimentellen Epilepsie-Modellen erhobenen Daten dieser Arbeit bestärken einerseits die Multidrug-Transporter-Hypothese der Pharmakoresistenz von Epilepsien und andererseits bieten sie neue Erkenntnisse über die mögliche Bedeutung von morphologischen Veränderungen bei pharmakoresistenter Epilepsie. Die gewonnenen Erkenntnisse können für die Entwicklung neuer Antiepileptika bzw. therapeutischer Strategien für die Pharmakotherapie bislang pharmakoresistenter Patienten genutzt werden.

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Volk, Holger: Untersuchung der Mechanismen von Pharmakoresistenz in verschiedenen Epilepsiemodellen. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

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