Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

In-vitro- und in-vivo-Charakterisierung einer LmxMPK5-Deletionsmutante von Leishmania mexicana

Wanders, Petra

Leishmaniases constitute a globally widespread group of parasitic infections transmitted through the phlebotomine sandfly. With 12 million infected people they represent a major health problem especially in subtropical and tropical regions. Depending on the Leishmania species and on the immune status of the infected host leishmaniases can cause clinical manifestations ranging from self-healing cutane lesions to lethal visceral infections characterized by fever, weight loss, swelling of the spleen and liver as well as anaemia. Most of the drugs available are insufficient and lead to toxic side effects and, importantly, become less efficient because of durg resistance. Thus, there is an urgent need of novel therapeutics to treat Leishmania infections. One possible approach is the interruption of the signalling cascade of the parasite thereby stopping its proliferation and differentiation in the host. In this connection, mitogen-activated protein kinases (MAPKs) represent potential targets for kinase inhibitiors. While many MAPKs are already known in mammals, there are only nine genes encoding MAPK homologues identified in Leishmania mexicana. Here, the role of the recently identified MAPK, LmxMPK5, has been studied. Immunoblotting revealed, that LmxMPK5 is always present in L. mexicana in vitro. However, it seems to be more expressed in amastigotes than in promastigotes. The characterization of the LmxMPK5 knock out mutant showed that the defect neither affects the differentiation nor the morphology of the parasites. In contrast, the knock out of LmxMPK5 was leading to significantly decreased proliferation of both promastigotes and amastigotes. Moreover, the reintegration of LmxMPK5 into its original gene locus restored the proliferative capacity of Leishmania amastigotes in macrophages in vitro thereby demonstrating the specificity of this phenotype. Although the virulence of the parasites in vitro was similar to the wildtype, the development of clinical leishmaniasis in mice infected with the knockout mutant was highly impaired. In fact, infected mice showed no clinical symptoms even after 1.5 years, when animals were sacrificed for further examination. On the other hand, the preparation and histological analysis of these samples revealed the presence of cultivatable persisting parasites. Finally, in the attempt to study the intracellular localization of LmxMPK5 the chimeric LmxMPK5-eGFP construct has been generated and integrated into the rRNA locus of the knockout mutant. The proliferative capacity as well as virulence in mice was partially restored demonstrating the biological activity of the fusion protein. Fluorescence microscopy revealed that LmxMPK5-eGFP is localized in the cytosol but not in the nucleus of the parasites. These observations were in accord with additional results obtained from immune electron microscopy. In conclusion, the present study firstly demonstrates that LmxMPK5 plays an important role in proliferation of Leishmania and the development of leishmaniasis in mice. Therefore, LmxMPK5 constitutes a potential candidate as target for kinase inhibitors to stop disease progression and to lead to a better prognosis of infected patients.

Die Leishmaniose ist eine weltweit verbreitete Infektion, die durch Schmetterlingsmücken übertragen wird. Mit geschätzten 12 Millionen infizierten Menschen stellt sie ein großes Gesundheitsproblem insbesondere in den tropischen und subtropischen Regionen dar. Je nach der Leishmania-Art und dem Immunstatus des Wirtsorganismus gibt es bei der Leishmaniose ein breites Spektrum von Krankheitsbildern. Sie kann zu einer selbst heilenden kutanen Läsion bis hin zu einer letalen Infektion des gesamten retikulo-endothelialen Systems führen. Die derzeit verfügbaren Therapeutika sind in vielen Fällen nicht effizient und zuverlässig genug und besitzen oftmals starke Nebenwirkungen. Außerdem werden zunehmend Resistenzentwicklungen gegenüber diesen Wirkstoffen beobachtet. Auf der Suche nach neuen Therapieansätzen wird die Unterbrechung von Signaltransduktionswegen des Parasiten diskutiert, um dessen Differenzierung und Proliferation im Wirtsorganismus zu stoppen. Mitogenaktivierte Proteinkinasen (MAPKs) stellen eine für Inhibitoren geeignete Zielstruktur dar. In Säugerzellen ist bereits eine große Anzahl von MAPKs identifiziert und charakterisiert worden. Dagegen sind in Leishmania mexicana bisher erst neun MAPK-homologe DNA-Sequenzen bekannt, deren Funktionen noch weitestgehend unklar sind. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle einer weiteren MAPK, LmxMPK5, untersucht. Es wurde gezeigt, dass LmxMPK5 im amastigoten Stadium stärker als im promastigoten Stadium exprimiert wird. Anhand der Charakterisierung des Phänotyps einer Doppeldeletionsmutante von LmxMPK5 wurde die Funktion der Kinase untersucht. LmxMPK5 beeinflusste weder die Differenzierung im promastigoten oder amastigoten Stadium noch die Morphologie der Parasiten, wie Untersuchungen mittels Immunoblot sowie Phasenkontrast- und Rasterelektronenmikroskopie zeigten. Im Gegensatz dazu verminderte die Deletion von LmxMPK5 signifikant die Proliferation der promastigoten und amastigoten Stadien in vitro. Die Reintegration von LmxMPK5 in seinen ursprünglichen Genlokus auf einem Allel der Doppeldeletionsmutante erhöhte wiederum die Proliferation der amastigoten Stadien in Makrophagen in vitro. Die Infektiosität für murine Makrophagen in vitro wurde durch die Doppeldeletion nicht beeinflusst. Im Infektionsexperiment mit BALB/c-Mäusen wurde jedoch gezeigt, dass LmxMPK5 essenziell für die Entwicklung einer klinischen Leishmaniose ist. Zehn Wochen nach der Infektion mit der Doppeldeletionsmutante zeigten die Mäuse nur eine geringgradige Schwellung des infizierten Fußes, die sich über 1,5 Jahre nicht veränderte. Nach dieser Zeit konnten sowohl histologisch als auch über Anzüchtung in der Kultur im Fuß persistierende Leishmanien nachgewiesen werden. Um LmxMPK5 zu lokalisieren, wurde ein DNA-Konstrukt hergestellt, das für ein Fusionsprotein aus LmxMPK5 und dem grünfluoreszierenden Protein kodiert. Nach Integration in den rRNA-Lokus von L. mexicana zeigte diese Mutante eine im Vergleich zur Doppeldeletion gesteigerte Proliferation und Infektiosität. Fluoreszenzmikroskopisch wurde das Fusionsprotein sowohl im pro- als auch im amastigoten Stadium im Zytosol jedoch nicht im Nukleus lokalisiert. Dieses wurde mittels Immunelektronenmikroskopie bestätigt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass LmxMPK5 eine wichtige Rolle für die Proliferation von L. mexicana und für den Verlauf der Leishmaniose im Mausmodell besitzt. Somit erscheint LmxMPK5 als ein geeigneter Kandidat, dessen therapeutische Hemmung durch Kinaseinhibitoren eine Verbesserung der klinischen Leishmaniose ermöglichen könnte.

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Wanders, Petra: In-vitro- und in-vivo-Charakterisierung einer LmxMPK5-Deletionsmutante von Leishmania mexicana. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

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