Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Einfluss der wiederholten instrumentellen Samenübertragung und von Inseminatkomponenten auf Eigenschaften uteriner neutrophiler Granulozyten der Stute

Görgens, Alexandra

Coitus or artificial insemination (IS) in mares is always followed by an immigration of leukocytes into the endometrium and into the uterine lumen which is dominated by polymorphonuclear neutrophilic granulocytes (PMN). This physiological reaction aims at the elimination of residual spermatozoa and contaminating bacteria. After breeding, some mares develop a persistent endometritis, resulting in poor pregnancy rates. PMN are considered to play an important role in the pathogenesis of these breeding-induced, persistent endometritis. Rather few is known about the dynamics of the PMN influx into the uterus, especially after repeated IS, and about factors which exert an influence on this process. Further, less is known about the functional properties of intrauterine PMN. At first, an animal model for the simulation of a repeated IS has been established. The aim was to generate a methodological tool which allows for the quantification and characterization uterine PMN functionality after single or repeated IS as well as the analysis of the respective pregnancy rates. Initial experiments showed that intrauterine application of fresh semen and of the chemokine recombinant human Interleukin 8 (rhIL-8) result in a comparable PMN influx into the uterus. As already known from previous work with rhIL-8, fresh semen provoked maximal intrauterine PMN numbers six hours after IS, a number which is still elevated after 48 hours. Therefore, for simulated repeated IS, mares were infused with rhIL-8 on day 1 and 24 hours later inseminated with fresh semen. Mares of the control group received a single IS of fresh semen. To harvest uterine leukocytes, the uterus was flushed six hours after IS (or after infusion with rhIL-8) with phosphate buffered saline (PBS) – a technique similar to the embryo transfer technique. Flow cytometric methods were used to quantify immigrated uterine leukocytes as well as to test their viability, their morphology, their phenotype and their phagocytic capacity. All parameters were compared with contemporary separated blood PMN. Defined and reproducible experimental conditions were created by defining endometrium categories by histology and by clinical and microbiological examinations as well as by ovulation synchronization. All investigations were performed in two successive breeding seasons (two experiment sets). In the first experiment, the mean PMN influx was comparable after single and repeated IS (18-43 x 106 leukocytes/ml with ≥ 99% PMN). In both groups, uterine PMN showed up with altered expression densities of function associated surface molecules when compared to autologous blood PMN: MHC class I, CD44 and CD11a were always weaker expressed compared to blood PMN. No significant differences could be observed between uterine PMN which were attracted after single or (simulated) repeated IS. Compared to blood PMN, the phagocytosis of opsonized streptococci was significantly lower in uterine PMN of both animal groups. Again, no difference showed up between uterine PMN after single or repeated IS. In the second experiment, significantly elevated uterine PMN numbers (compared to the first experiment) could be observed after single IS (103 x 106 vs. 35 x 106 PMN/ml). Therefore, relevant insemination components were tested for their chemo-attractive potential in vitro (transmigration chamber). Sperm cells, especially those with damaged cell membrane proved to be chemo-attractive for blood PMN. The used skim milk / egg yolk-extender was equally chemo-attractive. In contrast, seminal plasma strongly inhibited the rhIL-8- and extender-induced PMN transmigration. This indicates, that under unfavorable conditions (low sperm cell viability, extender choice, removal of seminal plasma) the IS can result in a too strong and not physiological PMN influx into the uterus. The established animal model provided some evidence that repeated IS does not lead to a significant change in quality and quantity of intrauterine PMN. Initial data which indicate a decreased pregnancy rate after repeated IS should be validated in a larger mare population. Moreover, future studies should focus intensively on the inflammation regulating capacity of inseminate components - especially of the different semen extenders - and the consequences of a repeated IS in susceptible mares.

Im Anschluss an eine Bedeckung oder instrumentelle Samenübertragung (IS) kommt es bei der Stute immer zu einer von polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (PMN) dominierten Leukozytenimmigration in das Endometrium und in das Uteruslumen. Diese physiologische Reaktion dient v.a. der Elimination von überzähligen Spermien und kontaminierenden Bakterien aus der Gebärmutter. Einige Stuten entwickeln im Anschluss an eine Belegung eine persistierende Endometritis, die mit sinkenden Fruchtbarkeitsaussichten verbunden ist. Den PMN wird bei der Pathogenese der Belegungs-induzierten persistierenden Endometritis eine wichtige Rolle eingeräumt. Über die Dynamik des PMN-Influx in den Uterus v.a. nach wiederholter IS, über die diesen Prozess beeinflussenden Faktoren und die intrauterine PMN-Funktionalität bestehen nur lückenhafte Kenntnisse. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde ein Tiermodell zur Simulation einer wiederholten IS etabliert. Ziel war es, eine Methodik zu erarbeiten, die sowohl die Quantifizierung und die funktionelle Charakterisierung uteriner PMN nach einmaliger oder wiederholter IS als auch die Analyse der jeweiligen Trächtigkeitsraten ermöglicht. Initiale Experimente hatten gezeigt, dass es nach intrauteriner Applikation von Frischsamen und dem Chemokin rekombinantes humanes Interleukin 8 (rhIL-8) zu einem vergleichbaren PMN-Influx in die Gebärmutter kommt. Wie aus früheren Arbeiten für rhIL-8 bekannt, provoziert auch Frischsamen eine maximale intrauterine PMN-Zahl 6 Stunden nach der IS, die auch noch nach 48 Stunden erhöht ist. Zur simulierten wiederholten IS wurden die Stuten deshalb am Tag 1 mit rhIL-8 infundiert und 24 Stunden später mit Frischsamen besamt. In der Kontrollgruppe erfolgte eine einmalige IS von Frischsamen. Zur Gewinnung der uterinen Leukozyten wurde der Uterus in Anlehnung an die Embryotransfertechnik 6 Stunden nach IS oder rhIL-8-Infusion mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gespült. Die eingewanderten uterinen Leukozyten wurden hinsichtlich Anzahl, Vitalität, Morphologie, Immunphänotyp und Phagozytosefähigkeit charakterisiert. Zur Erfassung der genannten Parameter kam die Durchflusszytometrie zur Anwendung. Als Bezugsgrösse dienten jeweils die Resultate, die zeitgleich bei separierten autologen Blut-PMN ermittelt worden waren. Durch histologische Kategorisierung des Endometriums, klinische und mikrobiologische Untersuchungen sowie durch Ovulationssynchronisation wurden definierte und reproduzierbare Versuchsbedingungen geschaffen. Die Untersuchungen wurden in 2 Teilexperimenten in aufeinander folgenden Zuchtsaisons durchgeführt. Im ersten Teilexperiment war der durchschnittliche PMN-Influx nach einmaliger und wiederholter IS vergleichbar stark (18-43 x 106 Leukozyten/ml). Der PMN-Anteil an der Gesamtleukozytenpopulation lag jeweils über 99 %. Die uterinen PMN zeigten in beiden Gruppen im Vergleich zu autologen Blut-PMN Veränderungen in der Expressionsdichte funktionsassoziierter Oberflächenmoleküle. So wurden die Oberflächenmoleküle MHC-Klasse-I, CD44 und CD11a grundsätzlich schwächer exprimiert als auf den entsprechenden Blut-PMN. Es konnten keine signifikanten Expressionsunterschiede bei uterinen PMN nach einmaliger und simulierter wiederholter IS nachgewiesen werden. Bei der Phagozytose opsonisierter Staphylokokken wiesen die uterinen PMN beider Versuchsgruppen ebenfalls eine signifikant verringerte Aktivität im Gegensatz zu den Blut-PMN auf. Auch hier konnten keine Unterschiede zwischen einmaliger und wiederholter IS festgestellt werden. Das zweite Teilexperiment zeichnete sich durch einen im Vergleich zum ersten Teilexperiment signifikant erhöhten PMN-Influx nach einmaliger IS aus (103 x 106 vs. 35 x 106 PMN/ml). Deshalb wurden in nachfolgenden in-vitro-Experimenten mit Hilfe einer Transmigrationskammer relevante Inseminatkomponenten auf ihre chemoattraktive Potenz untersucht. Hier zeigte sich, dass Spermien mit zunehmender Membranschädigung direkt chemoattraktiv für aus dem Blut isolierte PMN sind. Der in-vivo eingesetzte Magermilch-Eidotter-Verdünner erwies sich ebenfalls als stark chemoattraktiv für PMN. Dagegen hemmte Seminalplasma potent die durch rhIL-8 und Frischsamenverdünner provozierte PMN-Transmigration. Dies deutet darauf hin, dass es bei der IS unter ungünstigen Bedingungen durch sinkende Spermienvitalität, durch die Verdünnerauswahl und die Entfernung des Seminalplasmas zu einem unphysiologisch starken PMN-Influx in den Uterus kommen kann. Das in dieser Arbeit etablierte Modell zur Simulation einer wiederholten IS lieferte erste Daten, die darauf schließen lassen, das es bei wiederholter IS zu keiner nennenswerten qualitativen und quantitativen Veränderung des PMN-Influx in den Uterus kommt. Erste orientierende Resultate, die auf abnehmende Fruchtbarkeitsaussichten nach wiederholter IS hindeuten, müssen an einer größeren Stutenpopulation validiert werden. Zukünftige Experimente sollten sich intensiv der entzündungsregulierenden Kapazität von Inseminatkomponenten, insbesondere der verschiedenen Samenverdünner und den Folgen einer wiederholten IS bei „empfänglichen“ Stuten widmen.

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Görgens, Alexandra: Einfluss der wiederholten instrumentellen Samenübertragung und von Inseminatkomponenten auf Eigenschaften uteriner neutrophiler Granulozyten der Stute. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

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