Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

In-vitro-Untersuchungen zur Reaktionsbreite und Funktion vakzineinduzierter, humaner T-Zellantworten

Bastian, Max

CD4+ T-cells interact with a range of closely related peptide ligands in the context of MHC-class-II-molecules. Some of these epitope variants confer negative TCR signals rendering T-cells irresponsive to agonistic peptides. This altered peptide ligand antagonism was initially described in-vitro, but increasing amount of data reveals its importance for cellular immune responses in-vivo. Protozoan parasite antigens exposed to the immune system frequently display allelic sequence dimorphism. It is hypothesized, that such highly ordered sequence dimorphisms are selected for and maintained by immune pressure. The aim of this study was to test, whether a plasmodium derived dimorphic T-cell epitope mediates immune evasion by altered T cell ligand antagonism. Human volunteers were vaccinated with an experimental malaria vaccine. The vaccine contains a dimorphic T-cell epitope from P. falciparum Merozoite Surface Protein 1. Six natural sequence variants of the epitope are described worldwide. Three distinct positions are occupied by either of two amino acids. A Series of 20 CD4+ T-cell clones specific for MSP-138-58 were established from three different, vaccinated volunteers and characterized in detail. The epitope was found to be presented in the context of different MHC-class-II-molecules and recognized by a range of different TCRs. A recombinant protein comprising MSP-123-100 was used to demonstrate, that the MSP-138-58 epitope is liberated from the natural sequence context by antigen processing events. This indicates, that vaccine induced T-cells probably become activated during natural infection. Vaccine induced T-cell clones were tested for cross reactivity to natural epitope variants. Out of twenty tested T-cell clones ten reacted to the vaccine variant only. Six recognized an additional closely related variant. So, for the majority of clones the proliferative response was restricted to the variant contained in the vaccine. A selection of T-cell clones was tested in altered peptide ligand inhibition assays. Seven out of sixteen tested clones showed a markedly reduced proliferation and cytokine secretion after preincubation with antagonistic epitope variants prior to stimulation with the agonist peptide. Similar effects were obtained with transfected autologous EBV lymphoblastoid cell lines that expressed the respective epitope variant endogenously and present it in the context of MHC-class-II-molecules. In summary, this study provides evidence that sequence dimorphism might be involved in immune evasion of P. falciparum. This could have serious implications for vaccine development.  In accordance with previous studies the data suggest, that cellular immune responses successfully primed by a semi conserved vaccine epitope are restricted to single epitope variants. In the course of multiple infections they presumably lack cross reactivity against different allelic variants. Coinfecting parasites expressing antagonistic epitope alleles could even lead to functional inactivation of established epitope specific T cell populations.

T-Helferzellen interagieren mit einem Spektrum verwandter Peptidliganden, die ihnen im Kontext von MHC-Klasse-II Molekülen präsentiert werden. Einige dieser Peptidliganden induzieren ein negatives TCR-Signal, das zur Anergisierung der betroffenen T-Zellen führt. Dieser Mechanismus, bekannt als altered peptide ligand antagonism, wird unter anderem von pathogenen Mikroorganismen benutzt. Bei pathogenen Protozoen werden in der Peptidsequenz von Proteinen, die dem Immunsystem des SŠugetierwirtes ausgesetzt sind, häufig Sequenzdimorphismen beobachtet. Möglicherweise stellen solche Sequenzdimorphismen ein natürliches Repertoire an verwandten T-Zellepitopen dar, das von den Pathogenen benutzt wird, um antigenspezifische T-Zellpopulationen funktionell auszuschalten. Im Rahmen einer Phase-I Impfstofferprobung am Menschen waren Probanden mit einer experimentellen Malariavakzine immunisiert worden. Diese Vakzine enthält eine von sechs weltweit bekannten dimorphen Varianten eines T-Zellepitopes aus dem Merozoite Surface Protein 1 von P. falciparum. An drei Positionen innerhalb des Epitopes finden sich dimorphe Aminosäureaustausche. Um zu überprüfen, ob natürlich vorkommende Epitopvarianten variantenspezifische T-Zellen beeinflussen können, wurden von drei der in der Impfstofferprobung immunisierten Probanden insgesamt zwanzig T-Helferzellklone etabliert und detailliert charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass das Epitop im Zusammenhang mit unterschiedlichen HLA-II Molekülen präsentiert und von unterschiedlichen TCRen erkannt werden kann. Mit Hilfe eines rekombinanten Proteinfragmentes wurde demonstriert, dass das Epitop von Antigenpräsentierenden Zellen aus dem natürlichen Sequenzkontext freigesetzt und präsentiert werden kann. Das legt den Schluss nahe, dass die untersuchten, vakzineinduzierte T-Zellen auch während einer natürlichen Infektion aktiviert werden. Die T-Zellklone wurden auf ihre Kreuzreaktivität gegenüber den natürlich vorkommenden Sequenzvarianten hin überprüft. Von den zwanzig getesteten Klonen erkannten zehn nur die im Impfstoff enthaltene und weitere sechs darüber hinaus zumeist deutlich schlechter- eine eng verwandte Variante des Epitopes. Vier Klone erkannten zusätzlich eine der anderen Varianten. Damit war die Mehrheit der Klone in ihrer Reaktivität auf die in der Vakzine enthaltene Variante beschränkt. Eine Auswahl der T-Zellklone wurde in Inhibitionsexperimenten untersucht. Sieben der sechzehn getesteten T-Zellklone zeigte nach Vorinkubation mit individuell unterschiedlichen, nichtstimulatorischen Epitopvarianten eine zum Teil deutlich reduzierte Aktivierbarkeit auf die in der Vakzine enthaltene Indexvariante. Ein ähnlicher Effekt wurde mit transfizierten, autologen EBV-Zellinien beobachtet, die die jeweiligen Epitopvarianten endogen exprimierten und im Zusammenhang mit HLA-II Molekülen präsentierten. Die vorliegende Arbeit legt damit den Schluss nahe, dass Sequenzdimorphismen, wie einer in dem untersuchten T-Zellepitop zu beobachten ist, im Zusammenhang mit Immunevasionsmechanismen von P. falciparum stehen. Das hat möglicherweise ernsthafte Implikationen für die Entwicklung von Impfstoffen, da impfstoffinduzierte T-Zellantworten in ihrer Reaktivität auf die in der Vakzine enthaltene  Epitopvariante beschränkt sind und möglicherweise durch antagonisierende Epitopvarianten deaktiviert werden. Damit können solche T-Zellen während multipler Infektionen mit Erregerstämmen, die unterschiedliche Epitopvarianten exprimieren, nicht adäquat reagieren, was ihren protektiven Effekt erheblich einschränken dürfte.

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Bastian, Max: In-vitro-Untersuchungen zur Reaktionsbreite und Funktion vakzineinduzierter, humaner T-Zellantworten. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

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