Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Durchführung eines Genomscans mit polymorphen DNA-Markern und Genomic Mismatch Scanning (GMS) bei Sus scrofa zur Detektion Hernia inguinalis/scrotalis assoziierter Genomregionen

Bornemann-Kolatzki, Kirsten

There are numerous references that genetic factors are involved in the development of hernia inguinalis/scrotalis. Neither in pigs nor in man the mode of inheritance could be clarified so far. Estimated heritabilities for hernias range from h2 = 0.2 to h2 > 0.6. The goal of this project was the identification of genomic regions that are associated with porcine hernia inguinalis/scrotalis. To achieve this both a genomewide linkage scan with polymorphic DNA-markers and genomic mismatch scanning (GMS), a method that rapidly enriches regions of identity by descent between two genomes, were performed. First of all E. coli mismatch repair enzymes MutH, MutL and MutS, which are necessary for GMS, were isolated and purified. The activity of MutH and MutS were determined by band-shift-assays. To isolate IBD-DNA by means of GMS, DNAs of related individuals belonging to the same generation (e.g. full sibs) or of related individuals of different generations (e.g. father and descendant) were used. Additionally, in one case DNAs of unrelated affected pigs were combined. IBD-DNA was isolated from all DNA combinations, with total yields ranging between 4 % and 9 % of the original DNA. Isolated IBD-DNA was cloned, sequenced and compared with the entries in the BLAST database. A total of 22 fragments of the IBD-DNA were chosen and for 14 of them the genomic location was determined by hybrid panel genotyping. The other eight IBD-DNA fragments could not be mapped but at least sequence homologies were determined to conclude either for the most likely chromosome based on comparative mapping or to find homologies to known porcine DNA-library clones. The genomescan was performed using 139 DNA-markers (133 microsatellites and six SNPs (INSL-3 A, INSL-3 B, RYR1, GH, LEP, HOXA10)). A total of 71 half-sib families were used (n = 437; pedigree I; 108 DNA-markers). Pedigree I was expanded to 84 half-sib families (n = 512; pedigree II) for finemapping. The markers were evenly distributed over the genome with a average distance of 21.29 cM (pedigree I) and additional markers were genotyped for the chromosomes, with existing linkage between markers and phenotype (pedigree II). Nonparametric linkage analysis and TDT-test of the genomescan data gave the following results: 1.         The number of alleles of the markers ranged between 2 and 18. The average information content is 38 %. Total genome coverage was 87 % (genomewide scan). 2.         Using 108 markers and pedigree I nonparametric singlepoint and multipoint linkage analyses showed linkage for regions on four chromosomes (3, 6, 7 and 12) with a NPL-score ≥ 1.96 and a probability value ≤ 0.05. On chromosome 15 four markers showed NPL-scores ≥ 1.96 in the multipoint analysis. 3.         Finemapping was carried out on chromosomes 3, 6, 7, 12 and 15 (31 additional markers). 4.         The results of the genomewide scan were confirmed by the finemapping results. 5.         Two regions on chromosome 3 (region I: between 12.4 cM and 19 cM; region II between 98.2 cM and 102.2 cM) showed significant NPL-scores. In comparison to the genomewide scan, region I scaled up and NPL-scores increased, whereas region II scaled down and NPL-scores decreased. GUSB, HBX24 (region I) and LHCGR (region II) are located in the respective regions and are presumably candidate genes for hernia. The TDT-test confirmed the results of the nonparametric linkage analysis for this chromosome. 6.         On chromosome 6 between positions 71.4 cM and 96.1 cM linkage with the phenotype was verified. In comparison to analysis of pedigree I the region scaled up and is interrupted. The NPL-scores of the markers considered in both analyses decreased. The transforming growth factor beta 1 gene, a potential candidate gene, is located in this region. Besides this region, marker MP35 at position 0 cM showed linkage with the disease locus. The TDT-test statistic confirmed the results of the linkage analysis. 7.         On chromosome 7 the region between positions 58.5 cM to 59.7 cM reveals linkage with the trait. The NPL-score of marker SW472 kept constant. However, no association with hernia inguinalis/scrotalis was detected using the TDT-test. 8.         In this analysis the highest NPL-scores are detected on chromosome 12. A large region between 19.3 cM and 85.05 cM showed significant NPL-scores and covered more than half of the chromosome. In comparison to the analysis of pedigree I the region scaled up and NPL-scores increased clearly. GH, SOX9 and HOXB are located in this region and are potential candidate genes for hernia. The TDT-test statistic was significant for this region. 9.         On chromosome 15 linkage of the region between 13.8 cM and 25.7 cM exists with the trait. In comparison to the genomewide scan the NPL-scores decreased and the region scaled down. The HOXD-cluster is located on chromosome 15. Using the TDT-test no association between the chromosomal region and the phenotype could be determined. Comparison between the results of the two methods revealed that three IBD-DNA-fragments were located on chromosome 3 in a region, which was associated with the phenotype. Five IBD-DNA-fragments were assigned to chromosomes 7, 12 and 15, but did not fit to a region where linkage was determined. None of the further IBD-DNA-fragments was located on chromosomes with linkage to hernia inguinalis/scrotalis.

Das Auftreten von Hernia inguinalis/scrotalis kann, wie populationsgenetische Untersuchungen mehrerer Arbeitsgruppen gezeigt haben, auch genetisch bedingt sein. Weder beim Menschen noch beim Schwein konnte jedoch bisher der Vererbungsmodus eindeutig geklärt werden. Beim Schwein werden Hoden- und Leistenbrüche mit einer Heritabilität von h² = 0,2  bis h² > 0,6  vererbt. Ziel der Untersuchung war die Identifizierung von Genombereichen, die mit dem Merkmal Hernia inguinalis/scrotalis gekoppelt sind. In der vorliegenden Arbeit wurden dazu ein Genomscan mit polymorphen DNA-Markern und das Genomic mismatch scanning (GMS), das auf der Isolierung von IBD-DNA (identity by descent) beruht, durchgeführt. Zunächst wurden die E. coli Reparaturenzyme MutH, MutL und MutS, die für das GMS notwendig sind, isoliert und aufgereinigt. Die Aktivitätsbestimmung der Enzyme MutH und MutS erfolgte mittels Band-Shift-Assay. Zur Isolierung von IBD-DNA mittels GMS wurden sowohl DNAs verwandter Tiere einer Generation (z.B. Vollgeschwister) wie auch verwandter Tiere verschiedener Generationen (z.B. Vater und Nachkommen) eingesetzt. Zusätzlich wurde eine GMS-Kombination mit unverwandten Tieren, die eine Hernia inguinalis/scrotalis hatten, durchgeführt. Aus allen eingesetzten DNA-Kombinationen gelang es IBD-DNA zu isolieren, die Mengen lagen zwischen 4 % und 9 % der Ausgangs-DNAs. Die isolierten IBD-DNA-Fragmente wurden kloniert und anschließend sequenziert. Die Sequenzen der IBD-DNA-Fragmente wurden mit den Einträgen in der BLAST-Datenbank verglichen. Von den sequenzierten IBD-DNA-Fragmenten wurden 22 ausgewählt. Von diesen 22 Fragmenten gelang es 14 mittels ihrer Amplifikation auf Hybridpanels chromosomal zu zuordnen. Für die weiteren IBD-DNA-Fragmente sind durch den BLAST-Vergleich und über die dadurch bestimmten Sequenzhomologien wenigstens das wahrscheinlichste Chromosom oder ein Klon, aus einer porcinen DNA-Bank, bekannt. Für den Genomscan wurden insgesamt 139 DNA-Marker verwendet. Neben 133 Mikrosatelliten wurden sechs SNPs (INSL-3 A, INSL-3 B, RYR1, GH, LEP, HOXA10) untersucht. Es wurden zunächst 71 Halbgeschwisterfamilien (n = 437) für den Genomscan verwendet (Pedigree I). Dieses Pedigree I wurde im Laufe des Versuchs auf 84 Halbgeschwisterfamilien (n = 512) erweitert (Pedigree II). Die Marker wurden so gewählt, dass sie möglichst gleichmäßig das gesamte Genom abdeckten mit einem durchschnittlichen Abstand von 21,29 cM (Grobkartierung). Anschließend wurden die Chromosomen, für die eine Kopplung zwischen Marker und Phänotyp gefunden wurde, stärker mit Markern abgedeckt (Feinkartierung). Die Ergebnisse des Genomscans nach nichtparametrischer Kopplungsanalyse und TDT-Test lassen sich wie folgt zusammenfassen: 1.         Die Anzahl der Allele der eingesetzten DNA-Marker schwankt zwischen 2 und 18. Der durchschnittliche Informationsgehalt der Marker beträgt 38 %. Die Marker der Grobkartierung decken 87 % des Schweinegenoms ab. 2.         Sowohl in der Singlepoint-Analyse wie auch in der Multipoint-Analyse mit 108 Markern am Pedigree I wurden auf vier Chromosomen (3, 6, 7 und 12) eine Kopplung zu Markern mit einem NPL-Wert ³ 1,96 sowie einer Irrtumswahrscheinlichkeit ≤ 0,05 gefunden. Vier Marker auf Chromosom 15 wiesen zudem in der Multipoint-Analyse NPL‑Werte von über 1,96 auf. 3.         Am Pedigree II wurde die Feinkartierung der Chromosomen 3, 6, 7, 12 und 15 mit 31 weiteren Markern durchgeführt. 4.         Die Ergebnisse der Grobkartierung wurden durch die Feinkartierung bestätigt. 5.         Auf Chromosom 3 liegen zwei Regionen (Region I: zwischen 12,4 cM und 19 cM; Region II: zwischen 98,2 cM und 102,2 cM) mit signifikanten NPL-Werten vor. Im Vergleich zur Grobkartierung vergrößerte sich Region I und die NPL-Werte stiegen an, während sich Region II verkleinerte und die NPL-Werte sanken. Innerhalb dieser Regionen liegen u.a. GUSB, HBX24 (Region I) und LHCGR (Region II), die als Kandidatengene für Hernien in Frage kommen. Die Ergebnisse der nichtparametrischen Kopplungsanalyse wurden mittels TDT-Test bestätigt. 6.         Auf Chromosom 6 konnte für den Bereich zwischen 71,4 cM und 96,1 cM  eine Kopplung mit dem Merkmal nachgewiesen werden. Die Region vergrößerte sich insgesamt im Vergleich zur Analyse am Pedigree I und ist jetzt zweigeteilt. Die NPL-Werte der Marker, die in beiden Analysen berücksichtigt wurden, sanken. Das Gen des Transforming Growth Factor beta 1 ist auf Chromosom 6 in dem gekoppelten Bereich lokalisiert und kommt als Kandidatengen für das untersuchte Merkmal in Betracht. Außerdem konnte für den Marker MP35 an Position 0 cM eine Kopplung mit dem Krankheitslocus nachgewiesen werden. Die TDT-Teststatistik unterstützt die Ergebnisse der Kopplungsanalyse. 7.         Das merkmalsgekoppelte Intervall auf Chromosom 7 erstreckt sich von Position 58,5 cM bis 59,7 cM. Der NPL-Wert des Markers SW472 an Position 58,5 cM nach Feinkartierung blieb im Vergleich zur Grobkartierung annährend konstant. Mittels TDT-Test konnte für keinen Marker des Genomscans auf Chromosom 7 eine Assoziation mit Hernia inguinalis/scrotalis nachgewiesen werden. 8.         Die höchsten NPL-Werte in der hier durchgeführten Analyse ergaben sich für Chromosom 12. Die Region mit signifikanten NPL-Werten erstreckt sich auf einen Bereich zwischen 19,3 cM und 85,05 cM und umfasst damit mehr als die Hälfte des Chromosoms. Diese Region vergrößerte sich im Vergleich zur Analyse am Pedigree I und die NPL-Werte stiegen deutlich an. GH, SOX9 und HOXB, die in dieser Region lokalisiert sind, sind als Kandidatengene für Hernien besonders interessant. Die Kopplung zum Merkmal in diesem Bereich konnte durch den TDT-Test bestätigt werden. 9.         Auf Chromosom 15 konnte für den Bereich zwischen 13,8 cM und 25,7 cM eine Kopplung mit dem Merkmal Hernia inguinalis/scrotalis nachgewiesen werden. Die NPL-Werte sanken im Vergleich zur Grobkartierung  und die Region verkleinerte sich. Das HOXD-Cluster, welches auf Chromosom 15 kartiert wurde, ist für die Entstehung von Hernien von Interesse. Für keinen Marker auf Chromosom 15 konnte mittels TDT-Test eine Assoziation mit dem Krankheitslocus bestimmt werden. Der Vergleich der beiden Verfahren zeigt, dass drei IBD-DNA-Fragemente auf Chromosom 3 in den Regionen lokalisiert sind, für die auch mittels Kopplungsanalyse ein Effekt auf die Entstehung von Hernien nachgewiesen wurde. Fünf weitere IBD-DNA-Fragmente wurden den Chromosomen 7, 12 und 15 zugeordnet. Sie sind allerdings distal der Regionen, für die eine Kopplung mit dem Merkmal bestimmt wurde, lokalisiert. Die weiteren IBD-DNA-Fragmente wurden auf Chromosomen lokalisiert, für die durch die Kopplungsanalyse kein Effekt auf Inguinal- und Scrotalhernien festgestellt wurde.

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Bornemann-Kolatzki, Kirsten: Durchführung eines Genomscans mit polymorphen DNA-Markern und Genomic Mismatch Scanning (GMS) bei Sus scrofa zur Detektion Hernia inguinalis/scrotalis assoziierter Genomregionen. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

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