Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Verlauf der postnatalen Entwicklung des Vitamin D-abhängigen Ca2+-Transportes im Dünndarm von Ferkeln

Brandenburger, Magnus

Time course of changes in intestinal calcium transport in piglets during early postnatal development were characterized. It was the aim of the study to further investigate which single steps of overall transepithelial Ca2+ absorption would come to what extent at what time after birth under control of the vitamin D hormone system. For this purpose, functional data were correlated with mRNA expression studies of genes involved in single transcellular Ca2+ transport steps, namely TRPV5, TRPV6, calbindin‑D9k and PMCA1b. Experiments were performed with piglets 7 to 45 days of age which were either treated with pharmacological doses of vitamin D3 or served as controls. Intestinal calcium absorption was studied by in vitro measurements of unidirectional flux rates of Ca2+ across intact isolated tissues from the upper small intestines in Ussing chambers. These data were compared with kinetic parameters of Ca2+ uptake into isolated brush-border membrane vesicles (BBMV). Relative mRNA quantification was performed by real-time RT‑PCR. Finally, the influence of age and treatment with vitamin D3 on the parameters was examined and a physiologically reasonable model for the specific behaviour of postnatal adaptation of intestinal calcium transport in pigs was proposed.   The following results were obtained:   1)      Plasma calcium concentration decreased with age during postnatal development from 3 mmol ∙ l-1 to levels around 2.5 mmol ∙ l-1. Piglets treated with vitamin D3 showed significantly higher concentrations of Ca2+ than control animals of the same age.   2)      A significantly higher net flux rate of Ca2+ (about 50 %) across jejunal tissues could be induced by IM injection of vitamin D3 72 hours prior to the experiments. The stimulated proportion could be blocked by ruthenium red (10 µmol ∙ l-1 on the mucosal side) by almost 50 %.   3)      While mRNA expression of TRPV6 rose significantly between 5- and 7-fold until day 45 after birth expression of PMCA1b mRNA declined by approximately 45 %. mRNA levels of TRPV5 and calbindin‑D9k remained nearly constant during the study. No effect on the mRNA expression could be observed for the examined genes neither for treatment with vitamin D3 72 hours prior to experiments nor after a shorter time interval.   4)      Maximum transport capacities of Ca2+ uptake in isolated BBMV decreased with age to almost 50 % of initial levels. Neither Vmax values nor Km values were influenced significantly by vitamin D3 treatment.   In contrast to most of the other surveys reported so far dealing with vitamin D3 or calcitriol effects, the present study describes postnatal development and regulation of intestinal Ca2+ absorption in pigs for normal, non-vitamin D deficient animals on a molecular and functional level. The results indicate that the high capability for Ca2+ absorption normally present in the neonate even from the first days after birth is suitable for providing a sufficient amount of this mineral for the newborn. With the piglets getting older, regulation of intestinal Ca2+ absorption is possibly maintained by increasing expression of the intracellular calcium shuttle calbindin‑D9k or the basolateral Ca2+ pump PMCA1b on protein levels. Posttranscriptional or posttranslational modifications of involved genes are also conceivable as well as a combination of the possibilities mentioned above.

Mit der vorliegenden Arbeit wurden Veränderungen der intestinalen Ca2+-Absorption beim Ferkel während der frühen postnatalen Entwicklung als Verlaufsstudie erfasst. Ferner sollte der Frage nachgegangen werden, welche Vorgänge bei gesunden, nicht Calcitriol-defizienten Tieren in welchem Umfang und zu welchem Zeitpunkt unter die Kontrolle von Vitamin D3 geraten. Zu diesem Zweck wurden die Daten funktioneller Analysen mit Ergebnissen molekularbiologischer Studien sowohl bei Vitamin D3-behandelten Ferkeln als auch bei Kontrolltieren im Alter von 7 bis 45 Lebenstagen verknüpft. Für die Untersuchungen wurden unidirektionale Ca2+-Fluxraten im vorderen Dünndarm in vitro mit Hilfe der Ussing-Kammer-Technik ermittelt. Darüber hinaus wurden Aufnahmestudien in isolierte Bürstensaummembranvesikel (BMSV) durchgeführt und die kinetischen Kenngrößen der Ca2+-Aufnahme bestimmt. Die mRNA-Expression wichtiger Gene des transzellulären Ca2+-Transportes, wie TRPV5, TRPV6, Calbindin‑D9k und PMCA1b, wurde mit Hilfe der Real-Time PCR-Methode quantifiziert. Nachfolgend konnte der Einfluss des Lebensalters und der Behandlung mit Vitamin D3 auf die untersuchten Parameter beurteilt werden. Abschließend wurde versucht, einen sinnvollen physiologischen Erklärungsansatz für die postnatale Anpassung des intestinalen Calciumtransports beim Schwein zu entwerfen.   Folgende Ergebnisse wurden erzielt:   1)      Die Ca2+-Gehalte im Plasma nahmen im Verlauf der beobachteten postnatalen Entwicklung von ca. 3 mmol ∙ l-1 auf Werte von etwa 2,5 mmol ∙ l-1 ab. Vitamin D3-behandelte Ferkel wiesen dabei signifikant höhere Ca2+-Konzentrationen als gleichaltrige Kontrolltiere auf.   2)      Durch die i. m. Injektion von Vitamin D3 72 h vor Versuchsbeginn konnte bei Absetzferkeln eine signifikant um etwa 50 % erhöhte Ca2+-Nettofluxrate am intakten Epithel induziert werden. Der stimulierte Anteil ließ sich in der Folge durch Zugabe von Ruthenium Rot (10 µmol ∙ l-1, mukosal) um etwa 50 % hemmen.   3)      Während die mRNA-Expression von TRPV6 bis Tag 45 p. n. signifikant um das fünf- bis siebenfache anstieg, nahmen die mRNA-Mengen von PMCA1b um ca. 45 % ab. Im selben Zeitraum blieben die mRNA-Gehalte von TRPV5 und Calbindin‑D9k relativ konstant. Ein Effekt auf die mRNA-Expression der untersuchten Gene durch die Applikation von Vit. D3 war weder 72 h nach der Injektion noch zu einem früheren Zeitpunkt nachzuweisen.   4)      Die maximalen Aufnahmeraten von Ca2+ in isolierte BSMV nahmen im Untersuchungszeitraum auf etwa die Hälfte ab. Hierbei ließ sich weder für die Vmax- noch die Km-Werte ein signifikanter Vit. D-Effekt aufzeigen.   Im Gegensatz zu den meisten bislang durchgeführten Untersuchungen über die Wirkung von Vitamin D3 bzw. Calcitriol ist mit der vorgelegten Studie die postnatale Entwicklung und die Regulation der intestinalen Ca2+-Absorption beim Schwein unter nicht Vit. D-defizienten Versuchsbedingungen auf molekularbiologischer und funktioneller Ebene dargestellt worden. Die Ergebnisse weisen dabei darauf hin, dass die bereits mit der Geburt ausgebildete relativ hohe aktive Ca2+-Absorption den Neonaten in der ersten Zeit eine ausreichende Versorgung bietet. Bei älteren Tieren hingegen ist die Regulation der enteralen Ca2+-Aufnahme durch einen gesteigerten Proteingehalt des intrazellulären Ca2+-Transportproteins Calbindin‑D9k, der basolateralen Ca2+-Pumpe PMCA1b oder durch posttranskriptionale bzw. posttranslationale Modifikationen der beteiligten Gene wahrscheinlich. Auch eine Kombination aus den zuvor genannten Möglichkeiten ist in Betracht zu ziehe

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Brandenburger, Magnus: Verlauf der postnatalen Entwicklung des Vitamin D-abhängigen Ca2+-Transportes im Dünndarm von Ferkeln. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

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