Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Detektion und Charakterisierung möglicher zellulärer Rezeptoren für das Virus der bovinen Virusdiarrhoe

Busse, Frauke-Regina

Together with classical swine fever virus (CSFV) and border disease virus (BDV) the bovine viral diarrhoea virus (BVD-virus) constitutes the genus flavivirus within the flaviviridae family. Infection of cattle with BVD virus induces a variety of clinical signs depending on the maturity of the immune system. The early phases of viral infection are of obvious importance for the understanding of cell tropism and pathogenesis. Multiple receptors have been postulated, among these the low density lipoprotein receptor (LDLR), heparansulfate (HS) and the bovine CD46 (boCD46). However, evidence arised from several experiments, that particularly the latter may not function as the only one to enable infection. In fact, the infection with BVD virus seems to be a multiple-step process in which more than one factor is involved. In this thesis the participation of already identified receptors in viral attachment and/or viral entry was investigated for several BVD virus laboratory strains and clinical isolates. To analyse the dependence of infection on boCD46-expression and on adaptation to cell culture, replication studies were performed with eleven BVD viruses. Experiments were carried out using a boCD46-expressing cell line (FBK, fetal bovine kidney) as well as the PT cells (bovine kidney), which obviously do not express the boCD46. Based on these experiments one BVD laboratory strain adapted to cell culture, a non-adapted, repeatedly passaged clinical isolate and a clinical isolate after three passages in FBK cells, were chosen for further investigation. Inhibition studies revealed that infection with these three isolates was not dependent on LDLR or HS, while infection was inhibited by anti-boCD46 monoclonal antibodies (MAbs). For the detection of further potential receptors, inhibition studies were performed with 64 MAbs, which showed cross-reactivity with FBK cells, from the Third International Workshop on Ruminant Leukocyte Antigens (3W-MAbs). Three 3W-MAbs reduced infection of all three BVD viruses in a specific and concentration-dependent manner. However, a complete inhibition was not detected, even if 3W-MAbs were used in combination with the anti-boCD46 MAbs. With two of the 3W‑MAbs, proteins with a molecular mass of about 23 kDa were precipitated from metabolically-labelled FBK cells. Moreover, proteins with the same molecular mass could be detected in the membrane fraction of several bovine culture cells and bovine leukocytes by Western blot analyses. For the isolation of the potential receptor, MAb MM65A was used for immunoaffinity chromatography with bovine leukocytes as a starting material. In addition to the ~23 kDa protein a 16 and a 26 kDa protein were eluted from the matrix. Preliminary mass spectrometry analyses of all three proteins as well as internal amino acid sequencing of two peptides of the 23 kDa protein did not reveal the identity of the target protein. Particularly the presumption that MM65A might be directed against CD9, which was based on flow cytometry analyses, could not be confirmed. Results from inhibition studies and Western blot analyses rather implicated that the target antigen is not CD9. Further investigations are needed to find whether MC1-R is the antigen of MAb MM65A. Future work is needed to identify the target antigen and putative receptor. In particular, efforts have to be made towards a more efficient isolation of the protein.

Das Virus der Bovinen Virusdiarrhoe (BVD-Virus) bildet zusammen mit dem Virus der Europäischen Schweinepest (CSFV) und dem Border Disease Virus (BDV) das Genus Pestivirus innerhalb der Familie Flaviviridae. Die Infektion mit dem BVD-Virus kann sich in einer Vielzahl von Krankheitsbildern äußern, die wesentlich vom Immunstatus des infizierten Tieres abhängen. Für das Verständnis des Zelltropismus und der Pathogenese ist die Kenntnis der an der Virusbindung und dem Viruseintritt beteiligten zellulären Strukturen von herausragender Bedeutung. Inzwischen wurden mehrere zelluläre Rezeptoren für das BVD-Virus postuliert. Am besten charakterisiert wurde dabei das bovine Homolog des CD46 (boCD46). Allerdings gibt es Hinweise, dass dieser Rezeptor vermutlich nicht alleine die Infektion vermitteln kann. Vielmehr scheint es sich auch bei der Infektion mit BVD-Viren um einen mehrschrittigen Prozess zu handeln, an dem mehr als ein zellulärer Faktor beteiligt ist. In der vorliegenden Arbeit wurde die Beteiligung von bereits identifizierten Rezeptoren an Virusbindung oder -eintritt für unterschiedliche BVD-Virusisolate und -Laborstämme untersucht. Um die Abhängigkeit der Infektion von der boCD46-Expression und eine mögliche Adaptation von BVD-Viren an Zellkulturbedingungen zu untersuchen, wurden Replikationsstudien mit elf BVD-Viren in boCD46-exprimierenden bovinen Kulturzellen (FKN, fetale Kälbernieren) sowie in den bovinen PT-Zellen (bovine Nierenzellen), für die eine boCD46-Expression nicht nachgewiesen werden konnte, durchgeführt. Auf der Basis dieser Untersuchungen wurde ein an FKN-Zellen adaptierter Laborstamm, ein nicht adaptiertes häufig passagiertes Feldisolat und ein erst drei Mal in Zellkultur vermehrtes Feldisolat für die weiteren Untersuchungen ausgewählt. In Inhibitionsstudien zeigte sich, dass die Infektion von FKN-Zellen mit den drei BVD-Viren zwar von boCD46, nicht jedoch von dem Low density lipoprotein Rezeptor (LDLR) oder Heparansulfat (HS) abhängig ist. Für die Detektion weiterer möglicher zellulärer Rezeptoren wurden Inhibitionsstudien mit 64 gegen bovine Leukozyten-Oberflächenantigene gerichteten monoklonalen Antikörpern des Third International Workshop on Ruminant Leukocyte Antigens (3W-mAk), die in der Durchflusszytometrie mit FKN-Zellen kreuzreagierten, untersucht. Drei mAk mit bisher unbekannter Spezifität inhibierten die Infektion spezifisch und konzentrationsabhängig. Allerdings konnte auch in Kombination mit einem gegen boCD46-gerichteten mAk keine vollständige Hemmung erzielt werden. Mit zwei der detektierten Antikörper konnten in FKN-Zellen Proteine mit Molmassen von ca. 23 kDa in der Radioimmunpräzipitation dargestellt werden. Ein Protein gleicher Molmasse wurde auch in den Membranfraktionen weiterer boviner Zelllinien sowie in Leukozyten mittels Westernblot Analyse nachgeweisen. Für die präparative Isolierung des Zielantigens wurde der Antikörper MM65A in der Immunaffinitätschromatographie eingesetzt. Als Ausgangsmaterial dienten Rinderleukozyten. Neben dem Protein von ca. 23 kDa enthielt die Elutionsfraktion zwei weitere Proteine mit Molmassen von 16 und 26 kDa. Vorläufige massenspektrometrische Untersuchungen aller drei Proteine und die Bestimmung interner Aminosäuresequenzen zweier mittels HPLC isolierter Peptide des 23 kDa-Proteins ergaben keine eindeutigen Hinweise auf die Identität des möglichen Rezeptors. Insbesondere konnte die auf durchflusszytometrischen Daten beruhende Vermutung, dass es sich bei dem von MM65A erkannten Antigen um das bovine Homolog des CD9 handelt, nicht bekräftigt werden. Vielmehr lieferten Inhibitionsstudien und Westernblot Analysen Anhaltspunkte, die gegen CD9 sprechen. Inwieweit der in der internen Aminosäuresequenzierung bestimmte Melanocortin-1-Rezeptor tatsächlich das Antigen des MM65A oder eine Verunreinigung darstellt, muß weiter geprüft werden. Für die Identifizierung des mutmaßlichen Rezeptors müssen daher weitere Untersuchungen folgen. Dazu müssen insbesondere Methoden ausgearbeitet werden, die es ermöglichen, die Reinheit des Proteins für die weitere proteinchemische Analyse zu verbessern sowie die Menge des Proteins zu erhöhen.

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Busse, Frauke-Regina: Detektion und Charakterisierung möglicher zellulärer Rezeptoren für das Virus der bovinen Virusdiarrhoe. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

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