Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Identifikation infektionsrelevanter Antigene von Aspergillus fumigatus

Denikus, Nicole

Aspergillus fumigatus is the most important mould causing invasive mycosis in immunocompromised patients, e.g. suffering from leukemia, with incidence rates of 5 to 25%. Despite recent advances in treatment modalities, systemic aspergillosis still remains a mostly fatal disease in this patient population. Natural resistance against Aspergillus is mediated by the innate immune system. In addition, however, acquired immunity after systemic infection has been documented in animals. Thus, fungal antigens expressed in the course of the disease may elicit a specific, protective immune response. Identification of those antigens is a prerequisite for the development of vaccines envisioned to be offered to high risk patients. For this purpose, a rabbit model of sublethal aspergillosis was established. Sera of 6 rabbits were used to screen an Aspergillus l-phage-cDNA-expression library. Screening more than 2 million phage plaques, only 180 plaques were detected as reactive, representing the cDNAs encoding 36 different antigens only, a comparably small number in respect to an anticipated 10 000 genes being present in the genome of Aspergillus. Among those antigens, the cDNAs of which were all subcloned into plasmids, sequenced and analysed according to a preliminary annotation of the unfinished A. fumigatus genome, most seem to have an intracellular location. However, in two other pathogenic fungi, Candida albicans and Histoplasma capsulatum a number of intracellular proteins, especially heat shock proteins (HSPs) and enolase conferred immunity in vaccination trials. In Leishmania, a human and animal parasite, the intracellular elongation factor 1 (EGF-1) was shown to elicit a protective immune response against the respective disease. Indeed, Aspergillus’ homologues of various HSPs, of the enolase and of EGF1 were identified as strongly reacting antigens by this investigation as well. In addition, a GPI-anchored, and thus presumably membrane or cell wall associated glucanase of A. fumigatus was detected as a strongly reacting antigen in the sera of two rabbits. Interestingly, this very antigen, up to now, is the first and only molecule which has recently been shown to mediate a protective immune response against invasive aspergillosis in mice (Bozza et al. 2002, Microbes and Infection 4, 1281-1290). Thus, most likely, other antigens identified by this investigation are also promising vaccine candidates. Three of them were already expressed recombinantly in Escherichia coli. Others will follow in future and will be tested in trials eventually with the aim to improve the overall prognosis of immunocompromised patients.

Der Schimmelpilz Aspergillus fumigatus ist der wichtigste Erreger invasiver Mykosen bei immunsupprimierten Patienten (Inzidenz bei Leukämiepatienten z. B. 5-25%). Trotz jüngster therapeutischer Fortschritte verläuft die systemische Aspergillose meistens tödlich. Natürliche Resistenz gegen Aspergillus wird zwar durch das angeborene Immunsystem vermittelt, jedoch wurde im Tierversuch erworbene Immunität nach einer systemischen Infektion festgestellt. Demzufolge sollten Antigene, die im Verlauf der Erkrankung exprimiert werden, eine spezifische und protektive Immunantwort hervorrufen. Die Identifikation solcher Antigene ist eine Grundvoraussetzung für die Entwicklung von Impfstoffen für Risikopatienten. Zu diesem Zweck wurde in dieser Arbeit ein Kaninchenmodell einer subletalen Aspergillose etabliert. Von 6 Tieren wurden Infektionsseren für ein Screening einer Aspergillus-λ-Phagen-cDNA-Expressionsbank verwendet. Von mehr als 2 Millionen gescreenten Phagenplaques waren nur 180 reaktiv. Die cDNA aller Phagenklone wurde subkloniert und sequenziert. Ihre Analyse mithilfe des bislang vorläufig annotierten Aspergillus-Genoms erbrachte abzüglich Redundanz eine Gesamtzahl von 36 verschiedenen Antigenen. Eine geringe Anzahl wenn berücksichtigt wird, dass das Genom von Aspergillus etwa 10.000 Gene umfasst. Die meisten identifizierten Moleküle scheinen primär intrazellulär lokalisiert zu sein. So fanden sich z. B. verschiedene Heat Shock Proteine (HSPs), Enolase oder der Elongationsfaktor 1. Trotz ihrer intrazellulären Lokalisation zählen diese Antigene als wertvolle Vakzinekandidaten, denn bei anderen pathogenen Pilzen wie Candida albicans und Histoplasma capsulatum sind bereits ebenfalls Heat Shock Proteine (HSPs) und Enolase als immunitätsvermittelnde Antigene beschrieben worden. Außerdem konnte durch Verimpfung des homologen Elongationsfaktors-1 (EGF-1) bei Leishmanien eine protektive Immunantwort erzeugt werden. Zwei der in dieser Arbeit verwendeten Kaninchen zeigten starke Immunreaktionen gegen eine GPI-verankerte Glucanase (Aspf 16), die vermutlich in der Zellmembran oder -wand lokalisiert ist. Interessanterweise ist dieses Antigen das bislang einzige Molekül von A. fumigatus, dem die Vermittlung einer protektiven Immunantwort im Mausmodell einer invasiven Aspergillose nachgewiesen werden konnte (BOZZA et al. 2002; Microbes and Infection 4, 1281-1290). Drei der hier identifizierten Antigene wurden bereits rekombinant in E. coli exprimiert. In Zukunft sollen weitere Antigene folgen. Ob sie sich als Impfstoffe gegen eine invasive Aspergillose eignen, soll in einem Mausmodell evaluiert werden. Bei Erfolg sind im Anschluss klinische Studien geplant.

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Denikus, Nicole: Identifikation infektionsrelevanter Antigene von Aspergillus fumigatus. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

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