Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Erstellung von Deletionsmutanten zur Untersuchung des Nitrat- und Nitritstoffwechsels von Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis und Mycobacterium bovis BCG

Diephaus-Borchers, Catharina

The aim of the first part of this work was to carry out a targeted deletion of the nirBD-genes. The nirBD-genecluster represents a region in the genome of M. tuberculosis showing homologous sequences towards the Anaerobic Nitrite Reductases of other bacteria. As M. tuberculosis and the vaccination-strain M. bovis BCG are almost equal concerning the genomic level, a nirBD-region was also detected in BCG. If these genes are functional and if they encode for an enzyme leading to nitrite reduction under anaerobic conditions was not known to this date. Using the M. bovis BCG-mutant SR106, already lacking nitrate reduction under anaerobic conditions from a successful deletion of the narGHJI-genecluster encoding the enzym Anaerobic Nitrate Reductase, a “double“-mutant should be established, unable to reduce neither nitrate nor nitrite. Two different shuttle plasmids carrying both an inactivated copy of the nirBD-genes as well as a hygromycin cassette and the sacB-gene of Bacillus subtillis were introduced into SR106 via electroporation. To isolate clones arising from double-crossover events in the homologous recombination-mediated crossover between the target gene on the chromosome and the plasmid copy, a positive-negative double-selection strategy was utilized. Both the resistence to hygromycin and the sacB-gene encoding for the enzyme Levansucrose served as a marker to select for allel-replacement and loss of vector sequences. Concerning the genotype-level, all of the resulting clones fullfilled these conditions. To test the phenotype of the mutants in vivo, a functional essay followed comparing the mutants with the wild type M. bovis BCG. It became obvious that the replacement of the wildtype-gene with an inactive copy had no noticiable effect: all of the four clones carried on reducing nitrite to ammonia and therefore did not accomplishe the expected characteristics on the phenotype-level. This led to the thought that the nirBD-genes might not have been deleted enough to result in a loss of function of the enzyme. Also the test-system used could have been not suitable to detect anaerobic nitrite reduction. A plasmid carrying a copy of the genes with a larger deletion and a more sensitive test-system like gas-chromatography combined with mass-spectrometry could be used to for further work.   Both the next two parts of this work dealt with the examination the enzyme Anaerobic Nitrate Reductase in the pathogenic strains M. tuberculosis and M. bovis. To gain more information about a possible connection between pathogenity and ability to reduce nitrate under anaerobic conditions two pathogenic strains M. bovis and M. tuberculosis as well as the non-pathogenic tuberculosis vaccination-strain M. bovis BCG were compared facing anaerobic conditions. M. tuberculosis showed immediately a strong and fast activity of the enzyme compared to the M. bovis-strain which Nitrate Reductase-activity started slower. The vaccination-strain M. bovis BCG showed less ability to reduce nitrate under anaerobic conditions. It was remarkable that both the pathogenic strains were characterized by a clear Nitrate Reductase activity that was stronger than the activity of the non-pathogenic vaccination-strain BCG. With the M. bovis BCG-strain SR106, a mutant lacking nitrate reduction under anaerobic conditions due to a deletion in the narG-gene was already established. Therefore, the next intention was to accomplish the same targeted deletion in a pathogenic strain by using the non-replicating vector pSR14 carrying a copy of the narGHJI-genecluster with a deletion in the narG-subunit. But after three attemps to transform the vector into the M. tuberculosis-strain H37Rv using electroporation, non of the clones showed signs of a successful plasmid integration in PCR- and Southern-Blot screening. In parallel to this transformation-efforts, the M. bovis strain R99 was used for gene-deletion, were the integration of the vector pSR14 into the genome of R99 was successful. After a dual selection for the clones arising from double-crossover events leading to allele replacement and loss of vector sequences, two clones were obtained, fullfilling all criteria of mutants on the phenotype-level. This was acknowledged in the following functional assay: both clones did not reduce nitrate under anaerobic conditions. If this gene-deletion will lead to an attenuation of the mutants in vitro has to be examinated in further work.

Die Zielsetzung des ersten Abschnittes dieser Arbeit war es, eine Deletion der nirBD-Gene durchzuführen. Das nirBD-Gencluster stellt dabei eine Region innerhalb des Genomes von M. tuberculosis dar, die eine große Homologie zu den Nitritreduktase anderer Bakterien aufweist. Da M. tuberculosis und der Impfstamm M. bovis BCG auf genomischer Ebene praktisch identisch sind, konnte auch bei BCG die Region nirBD identifiziert werden. Ob diese Gene funktionell aktiv sind und für ein Enzym kodieren, war nicht bekannt. Unter der Verwendung der M. bovis BCG-Mutante SR106, die aufgrund einer zuvor erfolgreich durchgeführten Deletion im narGHJI-Gencluster der anaeroben Nitratreduktase bereits nicht mehr in der Lage ist, unter anaeroben Bedingungen Nitrat zu Nitrit zu reduzieren, sollte eine „Doppel-Deletionsmutante“ entstehen, die weder Nitrat noch Nitrit anaerob verstoffwechseln kann. Dafür wurden zwei verschiedene Plasmide mit Hilfe der Elektroporation in SR106 eingeschleust, die beide eine deletierte Kopie der nirBD-Gene sowie eine Hygromycin-Kassette und das sacB-Gen von Bacillus subtillis ( Lävan-Saccharose ) trugen. Um gezielt die Klone zu finden, welche aus „double-cross-over“-Ereignissen durch homologe Rekombination zwischen dem Ziel-Gen in Genom von SR106 und der Kopie auf dem Plasmid resultierten, wurde eine doppelte Selektions-Strategie mit je einem positiven und einem negativen Marker angewandt. Sowohl die Hygromycin-Resistenz als auch die sacB-Kassette dienten als Selektionsmarker, mit deren Hilfe die Klone gefunden werden sollten, die durch den Allel-Austausch und den Verlust der Vektor-Sequenzen nirBD-Deletionsmutanten darstellten. In Bezug auf die genotypische Ebene erfüllten  alle auf diese Weise gewonnenen Klone die Bedingungen. Im anschließenden Funktionstest hingegen zeigte sich aber, dass in vitro der Austausch der nirBD-Gene gegen eine inaktivierte Kopie keine erkennbaren Auswirkungen auf die Nitritreduktase-Aktivität zu haben schien: alle vier Klone reduzierten weiterhin Nitrit zu Ammonium und erfüllten somit auf phänotypischer Ebene nicht die Kriterien von nirBD-Deletionsmutanten. Dies legte die Überlegung nahe, ob die nirBD-Gene im Zuge der angewandten molekulargenetischen Methoden überhaupt ausreichend deletiert werden konnten, um ihre Funktion völlig zu verlieren oder ob das verwendete Testsystem nicht geeignet war, die Nitritreduktase-Aktivität zu messsen. Die Verwendung eines Plasmides mit größerer Deletion in nirBD oder der Einsatz eines sensitiveren Testystemes wie z.B. die Gaschromatographie/Massenspektometrie könnten dies klären.   Die beiden nächste Abschnitt der Arbeit beschäftigten sich mit der Untersuchung der anaeroben Nitratreduktase der pathogenen Stämme M. tuberculosis und M. bovis. Um mögliche Zusammenhänge zwischen der Pathogenität des jeweiligen Stammes und der Fähigkeit zur Nitratreduktion unter anaeroben Bedingungen  zu untersuchen, wurden M. tuberculosis und M. bovis sowie der apathogene Tuberkulose-Impfstamm M. bovis BCG einander unter anaeroben Bedingungen in einem Funktionstest gegenübergestellt. Dabei zeigte sich, dass M. tuberculosis eine sehr starke Nitratreduktase-Aktivität exprimierte. Bei M. bovis erfolgte eine Reduktion von Nitrat zu Nitrit, die im Vergleich zu M. tuberculosis wesentlich langsamer einsetzte. Der Impfstamm BCG zeigte nur ein sehr geringes Nitritbildungsvermögen unter anaeroben Bedingungen. Auffallend war, dass beide pathogenen Stämme eine Nitratreduktase-Aktivität unter anaeroben Bedingungen exprimierten, die deutlich stärker war als die des apathogene Impfstamm BCG. Da mit SR106 bereits eine Nitratreduktase-Mutante im Impfstoff BCG vorhanden war, sollte als nächstes eine gezielte Deletion des narG-Gens in einem pathogenen Stamm unter Verwendung des nicht-replizierenden Vektors pSR14, welcher eine Kopie des narGHJI-Genclusters mit einer Deletion im der narG-Gen trägt, erfolgen. Aber auch nach drei Versuchen, das Plasmid in den M. tuberculosis-Stamm H37Rv zu transformieren, konnte bei keinem der mit PCR und Southern Blot-Analysen untersuchten Klone eine Integration von pSR14 in das Genom nachgewiesen werden. Parallel zu den Transformationsversuchen in H37Rv wurde auch der M. bovis-Stamm R99 für die Gen-Deletion verwendet. Hier gelang die Integration des Vektors pSR14 in das Genom von R99. Nach einer Doppel-Selektion für die Klone, welche aufgrund von doppelten „cross-over“ Ereignissen einen Allel-Austausch durchgeführt und somit auch die Vektorsequenzen verloren hatten, konnten zwei Klone detektiert werden, welche alle Kriterien von Mutanten auf dem genotypischen Level erfüllten. Dies konnte im nachfolgenden Funktionstest bestätigt werden: beide Klone reduzierten kein Nitrat unter anaeroben Bedingungen. Ob die Deletion zu einer Attenuierung der Mutanten im Tiermodell führen kann, muss nun getestet werden.

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Diephaus-Borchers, Catharina: Erstellung von Deletionsmutanten zur Untersuchung des Nitrat- und Nitritstoffwechsels von Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis und Mycobacterium bovis BCG. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

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