Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zur Regulation des Enzyms Arginase in humanen Granulozyten

Doschko, Gwendolyn Ulrike Maria

One of the central metabolic pathways in the murine immune system in the context of inflammation and cytotoxicity is the arginine metabolism of myeloid cells. Generally, in murine macrophages, granulocytes and dendritic cells the alternative key enzymes (inducible NO synthase and arginase) are regulated competitively by T cell cytokines. In order to analyse if this type of regulation is similar between different species the regulation of the enzyme arginase in human myeloid cells is the topic of this study. By separating leukocyte fractions of normal blood donors it was verified that the enzyme arginase is only expressed by granulocytes. In contrast to murine myeloid cells, human granulocytes already express high arginase activity constitutively (mean: 1644 ± 423 mU/mg protein). These results were confirmed with flow-cytometrically sorted granulocyte populations of high-purity by demonstrating protein expression and enzymatic activity. By repeatedly sampling 7 normal blood donors over time, it could be shown that each healthy donor shows a relatively constant level of granulocyte arginase activity over time, while individual values differ significantly between donors (variation index 16%). By analysis of purified granulocytes from patients with arginase I-deficiency, it was proven that human granulocytes express the hepatic isoform of arginase (arginase I) only and not the extrahepatic arginase II. It was then shown in cell culture experiments that the main arginase inducers (IL-4, IL-10, cAMP) and suppressors (IFN-γ, TNF-α) of the murine system do not alter arginase activity in human granulocytes. These results support the hypothesis of a fundamentally different function of the metabolism of arginine in the immune systems of both species. Also, a stimulation of human granulocytes with dexamethasone or the chemokine IL-8 does not lead to any significant modulation of constitutive arginase activity in vitro. The in vivo regulation of human granulocyte arginase was then examined. For this purpose, a total of 540 granulocyte samples were collected during long term monitoring of 51 patients after allogeneic stem cell transplantation and the various inflammatory and immunologic problems of the patients were correlated with the measured arginase activity of the purified granulocytes. Here it turned out that a significant modulation of arginase activity was neither seen in the context of infectious inflammation (sepsis, pneumonia, respiratory disease) nor in the context of non-infectious inflammation (Graft-versus-Host-Disease). Again, these results contrast sharply with the murine system in which arginase within involved myeloid cells is regulated by many cytokine–mediated inflammatory processes. In contrast, a significant positive correlation of arginase activity in granulocytes was seen in the context of therapeutical application of glucocorticoids. In 68% of the patients the steroid dose correlated positively with arginase activity of granulocytes. It was shown that an increase in granulocyte arginase activity is seen only after at least 48 h of steroid therapy. By quantifying arginase I and IL-8 mRNA in 388 granulocyte probes of 38 patients after allogeneic stem cell transplantation, a significant reciprocal correlation of both gene products could be demonstrated in 92% of these patients. This shows that the induction of pro-inflammatory cytokines in vivo (IL-8) is accompanied by a downregulation of arginase I in human granulocytes or vice versa that an increase of granulocyte arginase might characterise a defined antiinflammatory phenotype of the human immune system

Einer der zentralen Stoffwechselwege im murinen Immunsystem im Rahmen von Inflammation und Zytotoxizität ist der Arginin-Metabolismus myeloischer Zellen. In murinen Makrophagen, Granulozyten und dendritischen Zellen erfolgt die Regulation der alternativen Schlüsselenzyme induzierbare NO-Synthase und Arginase meist streng dichotom durch T-Zell-Zytokine. Um zu prüfen, ob diese Regulation Spezies-übergreifend ähnlich erfolgt, war die Regulation des Enzyms Arginase in humanen myeloischen Zellen Gegenstand dieser Arbeit. Zunächst wurde an einem größeren Normalspender-Kollektiv durch Fraktionierung der Leukozyten verifiziert, dass das Enzym Arginase lediglich von Granulozyten exprimiert wird. Im Gegensatz zu murinen myeloischen Zellen exprimieren humane Granulozyten bereits konstitutiv eine hohe Arginaseaktivität (Mittelwert: 1644 ± 423 mU/mg Protein). Diese Ergebnisse wurden mit hochreinen, durchflusszytometrisch sortierten Granulozytenpopulationen durch Nachweis der Proteinexpression und der enzymatischen Aktivität bestätigt. Durch wiederholte Probengewinnung an einem Kollektiv von 7 Normalspendern konnte gezeigt werden, dass jeder klinisch gesunde Spender im Verlauf einen relativ konstanten Wert der Arginase-Aktivität zeigt, dieser Wert aber zwischen den Spendern variieren kann (VK: 16%). Durch Analyse aufgereinigter Granulozyten von Patienten mit Arginase I-Defizienz wurde schließlich bewiesen, dass humane Granulozyten ausschließlich die hepatische Isoform der Arginase (Arginase I) und nicht die extrahepatische Variante (Arginase II) exprimieren. In Zellkulturuntersuchungen zeigte es sich, dass die wesentlichen Arginase-Induktoren (IL-4, IL-10, cAMP) bzw. Suppressoren (IFN-γ, TNF-α) des murinen Systems in humanen Granulozyten keine Modulation der Arginaseaktivität bewirken. Diese Ergebnisse unterstützen die Hypothese einer grundsätzlich andersartigen Funktion des Arginin-Metabolismus in den Immunsystemen beider Spezies. Auch eine Stimulation humaner Granulozyten mit Dexamethason, Forskolin oder dem Chemokin IL-8 führte in vitro zu keiner signifikanten Modulation der konstitutiven Arginase-Aktivität. In einem weiteren Teil der Arbeit wurde die Regulation der humanen Granulozyten-Arginase in vivo untersucht. Hierzu wurden insgesamt 540 Granulozytenproben von 51 Patienten im Langzeitverlauf nach allogener Stammzelltransplantation gewonnen und die vielfältigen inflammatorischen und immunologischen Reaktionszustände dieses Kollektivs mit der jeweils gemessenen Arginase-Aktivität der aufgereinigten Granulozyten korreliert. Hierbei zeigte es sich, dass weder im Rahmen infektiöser Inflammation (v.a. Sepsis, Pneumonie, Atemwegsinfekt) noch im Rahmen nicht-infektiöser Inflammation (Graft-versus Host-Erkrankung) eine signifikante Modulation der Arginase-Aktivität feststellbar war. Auch diese Ergebnisse stehen im deutlichen Widerspruch zum murinen System, in dem die Arginase in zahlreichen zytokinvermittelten inflammatorischen Prozessen in den beteiligten myeloischen Zellen reguliert wird. Eine signifikante positive Korrelation der Arginase-Aktivität der Granulozyten zeigte sich dagegen im Rahmen einer therapeutischen Applikation von Glukokortikoiden. So war bei 68% der Patienten die Steroiddosis positiv korreliert mit der Arginase-Aktivität der Granulozyten. Es wurde gezeigt, dass dieser Effekt erst mit einer zeitlichen Latenz von 48 h nach dem Beginn der Steroidtherapie feststellbar ist. Durch Quantifizierung der Arginase I und IL-8 mRNA in 388 Granulozytenproben von 38 Patienten im Langzeitverlauf wurde abschließend bei 92% der Patienten eine signifikante reziproke Korrelation zwischen beiden Genprodukten nachgewiesen. Dies zeigt, dass die Induktion pro-inflammatorischer Zytokine in vivo (IL-8) von einer Suppression der Arginase I in humanen Granulozyten begleitet werden könnte oder im Gegenzug ein Anstieg der Arginaseaktivität in den Granulozyten eine spezielle anti-inflammatorische Reaktionslage des humanen Immunsystems charakterisieren könnte. 

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Doschko, Gwendolyn Ulrike Maria: Untersuchungen zur Regulation des Enzyms Arginase in humanen Granulozyten. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

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