Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Einflüsse unterschiedlicher Verfahren zur Sperma-Tiefgefrierkonservierung auf Motilität und Membranintegrität von Hundespermien

Gröpper, Barbara

Aimes of the present study were to verify the influence of different equilibration times (1.5 and 3 hours) on the quality of dog spermatozoa diluted with and without 0.5% Equex STM paste (experiment I) and the influence of 0.5% Equex STM paste as an additive to a Tris-egg yolk-fructose-citrate extender on motility, volume regulation, acrosome and membrane integrity of dog spermatozoa during deep freezing (experiment II). Ejaculates of four Beagle dogs were examined after equilibration for 1.5 and   3 hours using the split sample method (experiment I). In experiment II ejaculates of eight Beagle dogs were analyzed after dilution and adaptation to room temperature for 15 minutes, as well as after deep freezing and thawing. The assessment of the sperm quality was evaluated according to classical (microscopic estimation of motility, microscopic examination of acrosome morphology) and modern spermatological methods (computer-assisted motility analysis, computer-aided analysis of volume regulation, flowcytometric determination of acrosome and membrane integrity). The computer-aided analysis of the sperm volume regulation was determined after a 5 and 20 minutes incubation of the spermatozoa at 39°C under iso-, hypo-, and hypertonic conditions. The amount of acrosome reacted and membrane damaged spermatozoa was determined after incubation with the Ca2+-ionophor A23187 for induction of the acrosome reaction. According to the results of the present study, the equilibration time (1.5 and 3 hours) has no effect on sperm quality. Volumetric and morphologic sperm parameters are indicating temperature and time dependent changes of integrity and function of the sperm plasma membrane. Altogether, addition of Equex STM paste to the extender had different effects on individual parameters depending on the step of cryopreservation, referring to a central role of the integrity and function of the plasma membrane and acrosome. Especially, the proportion of osmotically active spermatozoa in the volume distribution curve, the modal volume measured under isotonic conditions, and the acrosome integrity of the spermatozoa were positively affected by adding Equex to the extender. For almost all parameters measured in thawed semen using modern spermatological methods, individual differences among dogs were identified. Different correlations in thawed semen samples diluted with Equex elucidated connections between different functional parameters [modal volume of the spermatozoa under isotonic (5 minutes incubation) and hypotonic conditions  (5 and 20 minutes incubation), relative increase of the sperm volume (5 minutes incubation), RVD and sperm velocity] and between functional and morphological parameters [modal volume of the sperm under hypertonic conditions (5 and 20 minutes incubation), relative decrease of the sperm volume (20 minutes incubation), RVI and acrosome integrity as well as modal volume of the spermatozoa under isotonic (20 minutes incubation) and hypotonic conditions (5 and 20 minutes incubation) and ability to induce the acrosome reaction]. These results suggest that addition of 0.5% Equex STM paste to the extender can be recommended for deep freezing of dog semen. The investigation of the exact mode of action of Equex STM paste on a molecular level remains to be the objective of further studies. Due to their high sensitivity and fast acquisition of additional parameters, modern analytical methods provide valuable data for the investigation of unknown seminal processes, which can contribute to the development of a more efficient procedure for the cryopreservation of dog semen.

Ziele der vorliegenden Studie waren die Überprüfung der Auswirkung unterschiedlicher Äquilibrierungszeiten (1,5 und 3 Stunden) auf die Eigenschaften ohne und mit 0,5% Equex STM Paste verdünnten Hundespermas (Versuchsteil I) und die Überprüfung der Wirkung von 0,5 % Equex STM Paste als Zusatz zum Tris-Eidotter-Fruktose-Citrat-Verdünner auf die Motilität, Volumenregulation, Akrosom- und Membranintegrität von Hundespermien im Verlauf des Tiefgefrierprozesses (Versuchsteil II). Dazu wurden zunächst Ejakulate von vier Beagle-Rüden nach 1,5- und 3-stündiger Äquilibrierung im Splitsample-Verfahren untersucht   (Versuchsteil I). Im Versuchsteil II wurden Ejakulate von acht Beagle-Rüden nach Verdünnung und 15-minütiger Anpassung an Raumtemperatur und nach dem Tiefgefrieren und Auftauen analysiert. Die Beurteilung der Spermabeschaffenheit erfolgte anhand klassischer (mikroskopische Motilitätsschätzung, mikroskopische Untersuchung der Akrosommorphologie) und moderner spermatologischer Analyseverfahren (computergestütze Motilitätsanalyse, computergestütze Analyse der Volumenregulation, durchflusszytometrische Bestimmung der Akrosom- und Membranintegrität). Die computergestützte Analyse der Volumenregulation der Spermien erfolgte nach 5- und 20-minütiger Inkubation der Spermien bei 39°C unter iso-, hypo- und hypertonen Bedingungen. Die Bestimmung der Anteile akrosomreagierter und membrangeschädigter Spermien wurde nach Inkubation zur Induktion der Akrosomreaktion mit dem Ca2+-Ionophor A23187 vorgenommen. Nach Erkenntnissen der vorliegenden Studie hat die Äquilibrierungsdauer (1,5 und 3 Stunden) keinen Einfluss auf die Spermaqualität. Volumetrische und morphologische Spermienparameter weisen auf im Verlauf des Tiefgefrierprozesses stattfindende temperatur- und zeitabhängige Veränderungen der Plasmamembranintegrität und –funktionalität der Spermien hin. Insgesamt wirkte sich der Zusatz von Equex STM Paste im Verdünner abhängig vom Konservierungsschritt unterschiedlich auf die einzelnen Parameter aus, wobei der Integrität und Funktionalität der Plasmamembran und des Akrosoms der Spermien diesbezüglich eine zentrale Rolle zuzukommen scheint. Besonders der Anteil osmotisch aktiver Spermien in der Volumenverteilungskurve, das unter isotonen Bedingungen gemessene Modalvolumen und die Akrosomintegrität der Spermien wurden durch die Equex-Zugabe zum Verdünner positiv beeinflusst. Im aufgetauten Samen waren für annähernd alle mit modernen Analyseverfahren erhobenen Parameter individuelle Unterschiede der Rüden zu finden. Verschiedene Korrelationen in den mit Equex verdünnten, aufgetauten Samenproben verdeutlichten Zusammenhänge zwischen verschiedenen funktionellen Parametern [Modalvolumen der Spermien unter iso- (5 Minuten Inkubation) und hypotonen Bedingungen (5 und 20 Minuten Inkubation), relative Volumenvergrößerung der Spermien (5 Minuten Inkubation), RVD und Spermiengeschwindigkeiten] und zwischen funktionellen und morphologischen Parametern [Modalvolumen der Spermien unter hypertonen Bedingungen (5 und 20 Minuten Inkubation), relative Volumenverkleinerung der Spermien (20 Minuten Inkubation), RVI und Akrosomintegrität sowie Modalvolumen der Spermien unter iso- (20 Minuten Inkubation) und hypotonen Bedingungen (5 und 20 Minuten Inkubation) und Induzierbarkeit der Akrosomreaktion]. Anhand der vorliegenden Ergebnisse kann der Einsatz von 0,5% Equex STM Paste als Verdünnerzusatz in der Tiefgefrierung von Rüdensamen befürwortet werden. Die Erforschung der genauen Wirkungsweise von Equex STM Paste auf molekularer Ebene muss dem Interesse weiterführender Studien überlassen bleiben. Moderne Analyseverfahren liefern durch ihre hohe Sensitivität und die schnelle Erfassung zusätzlicher Parameter wertvolle Daten zur Erforschung unbekannter spermatologischer Sachverhalte, die zur Entwicklung eines effizienteren Verfahrens der Tiefgefrierkonservierung von Hundesamen beitragen können. 

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Gröpper, Barbara: Einflüsse unterschiedlicher Verfahren zur Sperma-Tiefgefrierkonservierung auf Motilität und Membranintegrität von Hundespermien. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

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