Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Evaluierung der Anwendbarkeit quantitativer Genexpressionsanalysen an formalinfixiertem, paraffineingebettetem Gewebe

Hameier, Dorthe

With the development of sensitive detection techniques such as Real Time RT-PCR and DNA-array technique, quantification of gene expression has become a valuable tool for pathology in the last years and is performed routinely in many laboratories. This allows a better understanding of pathogenesis of disease and might show new approaches in therapy as well. As there is only a very limited number of fresh samples available, the investigation of rare tissue alterations or large numbers of samples remains difficult. This difficulty could be overcome by making the archived tissues in the pathologic institutes amenable to gene expression analysis. But the RNA contained is these tissues is vastly affected by tissue processing and for this reason it is questionable if this material is suitable for accurate quantification. In recent times this problem was thought to be solved by normalizing gene expression to a so called housekeeping-gene which is supposed to be expressed at constant levels. Therefore it is essential that ratios in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues are identical to those in equivalent fresh tissues. The systematic verification of this presumption is the central aspect of this study. For this purpose the most probable scenarios in routine tissue processing such as delayed fixation, prolonged fixation, different concentrations of fixative and long term storage were simulated under defined conditions using different tissues of four healthy beagle dogs. In these samples, the gene expression levels of four commonly used housekeeping-genes (HPRT, GAPDH, EF-1α and β-actin) and of the variable expressed gene MDR-1 were quantified using Real Time RT-PCR. Ratios between the different sequences were calculated and compared to those from correspondent unfixed tissues.   The results show that the presumption that normalization of gene expression rates to a housekeeping-gene allows accurate quantification of gene-expression in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues has to be drastically restrained: Amplifiable RNA could be easily extracted from all formalin-fixed, paraffin-embedded tissues in this study. Fixation lead to reduction of total-RNA by 50-80% and specific sequences by 95-99%. Prolonged fixation up to 6 days did not lead to further, significant, time-dependent reduction. Autolysis up to 6 hours did surprisingly not affect the extractable amount of total-RNA or specific sequences. Clear time-dependent loss of total-RNA and specific sequences appeared only after prefixation-times longer than 12 hours. Cutting samples into very small pieces did not improve the yield of total-RNA or lead to better results in quantification. A thickness of about 0,5 cm offers good results in analysis and is also suitable for commonly used histological capsules. Samples of 2 cm thickness offered poorer results than those with 0,5 cm. Long time storage up to 20 years did not lead to an obvious, time dependent reduction of total RNA or specific sequences. Formalin-fixation and paraffin-embedding lead to a drastic shift of ratios in the processed tissues. Only 5.4% of the values showed the same ratios as in fresh tissues while 15.5% simulated an over- or underexpression higher than factor 10. 79.2% of the values showed an up- or downregulation between factor 1.2 and 10. This effect could at least partially be overcome by analyzing groups of three similar samples. But this grouping lead to an increase of standard deviation which makes impossible to see smaller changes in gene-expression. Recapitulating it seems that a single formalin-fixed and paraffin-embedded sample is an insufficient source for quantitative gene expression studies, even if one of the commonly used housekeeping genes is used to normalize the results. In fact it appears to be meaningful to calculate the means between similar samples and to evaluate these using statistical methods. The observance that the retrospectively often not traceable influences prefixation time and time of fixation and also the time of storage do not have a grave influence on expression analysis is quite encouraging for future investigations. Further investigations have to show if the results of this thesis can be transferred to microdissected tissues that will be of increasing relevance in future pathological studies.

Die Quantifizierung von Genexpressionsraten hat in den vergangenen Jahren in der Pathologie immer mehr an Bedeutung gewonnen und wird durch die Entwicklung moderner Nachweisverfahren wie der Real Time RT-PCR in vielen Labors heute routinemäßig durchgeführt. Damit ist es möglich, ein besseres Verständnis für die Pathogenese zahlreicher Krankheitsbilder zu gewinnen und möglicherweise neue Therapieansätze zu entwickeln. Problematisch ist allerdings gerade bei seltenen Krankheiten die relativ geringe Zahl der laufend verfügbaren Gewebeproben. Daher wäre es von großem Interesse, das in den pathologischen Instituten archivierte Gewebe für derartige Untersuchungen nutzbar machen zu können. Durch Formalinfixierung und Paraffineinbettung nimmt die in diesem Gewebe enthaltene mRNA jedoch bekanntermaßen Schaden, so dass es unklar ist, in wieweit Genexpressionsraten in derartig prozessierten Proben ohne Artefakte zu quantifizieren sind. Allgemein wird versucht, dieses Problem zu lösen, indem das Verhältnis des zu untersuchenden Zielgens zu einem konstant exprimierten Housekeeping-Gen ermittelt wird. Dafür ist eine wichtige Voraussetzung, dass die Relationen zwischen verschiedenen mRNA-Sequenzen im formalinfixierten, paraffineingebetteten Gewebe denen im Frischmaterial entsprechen. Diese Annahme sollte in der vorliegenden Arbeit systematisch geprüft werden, indem in unter definierten Bedingungen prozessierten Proben verschiedener Organe vier gesunder Hunde der Einfluss von Formalinfixierung und Paraffineinbettung, Fixierungsdauer, Autolysezeit, Probengröße und Langzeitlagerung untersucht wurde. Dazu wurde die mRNA des variabel exprimierten Gens MDR-1 (Multi- Drug-Resistance-Protein 1) sowie die mRNA von vier so genannten Housekeeping-Genen (HPRT, GAPDH, EF-1α und β-Aktin) in der Real Time RT-PCR quantifiziert, die Relationen zueinander errechnet und die Ergebnisse zwischen frischem und formalinfixiertem, paraffineingebettetem Gewebe verglichen. Die Ergebnisse zeigen, dass die zentrale Arbeitshypothese, wonach die Verwendung eines Housekeeping-Gens die Quantifizierung von Genexpressionsraten in formalinfixiertem, paraffineingebettetem Gewebe ermöglicht, nur mit großen Einschränkungen gültig ist: Aus allen formalinfixierten, paraffineingebetteten Geweben konnte problemlos amplifizierbare RNA isoliert werden. Durch die Fixierung und Einbettung wird die Menge an isolierbarer Gesamt-RNA um etwa 50-80% und die Zahl der detektierbaren spezifischen mRNA-Sequenzen um etwa 95-99% reduziert. Die Dauer der Fixierung war dabei in den hier untersuchten Zeiträumen von bis zu 6 Tagen von untergeordneter Bedeutung. Der Einfluss der Autolyse auf die isolierbare Gesamt-RNA-Menge und auf die Zahlen der spezifischen mRNA-Moleküle war bis zu sechs Stunden überraschend gering, erst ab 12 Stunden traten klar zeitabhängige Verluste auf. Es bot keinen Vorteil für die Quantifizierung von mRNA-Molekülen, Proben mit besonders geringer Penetrationsdicke zu fixieren. Proben von etwa 0,5 cm Dicke lieferten gleichwertige Ergebnisse und ließen sich gut in die üblicherweise verwendeten Plastikkapseln einbringen. Gewebeproben mit 2 cm Dicke lieferten dagegen deutlich schlechtere Resultate als Proben mit einer Dicke von 0,5 cm. Die Lagerung von Paraffinblöcken über bis zu 20 Jahre führte zu keiner offensichtlichen zeitabhängigen Reduktion der Gesamt-RNA-Menge und der einzelnen mRNA-Moleküle. Durch Fixierung und Einbettung verschoben sich die Relationen zwischen den einzelnen mRNA-Sequenzen zum großen Teil dramatisch. Nur 5,4 % der Werte lagen im Bereich des Frischmaterials. 79,2 % der Werte täuschten eine Über- oder Unterexpression des fiktiven Zielgens MDR-1 um einen Faktor von zwischen 1,2 und 10 vor, während 15,5 % der Proben eine Abweichung um mehr als Faktor 10 zeigten. Dieser Effekt konnte jedoch teilweise überwunden werden, indem mindestens drei gleichartige Proben miteinander gemittelt wurden. Allerdings traten hier hohe Standardabweichungen auf, wodurch eher geringe Veränderungen der Expressionsmuster nicht mehr festgestellt werden könnten. Zusammengefasst erscheint es also wegen der zu erwartenden Artefakte wenig sinnvoll, die Genexpressionsraten in einer einzelnen, derart archivierten Probe zu quantifizieren. Vielmehr erscheint es ratsam, arithmetische Mittelwerte mehrerer, gleichartiger Proben zu bilden und die Ergebnisse mit statistischen Methoden zu bewerten. Die Beobachtung, dass die retrospektiv häufig nicht mehr nachvollziehbaren Einflüsse der Autolyse und Fixierungsdauer sowie der Langzeitlagerung keine gravierenden Einflüsse auf die Quantifizierung der mRNA hatten, ist für zukünftige Untersuchungen ermutigend. Weitere Untersuchungen müssen zeigen, ob die hier erarbeiteten Ergebnisse auch auf mikrodisseziertes Archivgewebe übertragbar sind, welches in der Pathologie zukünftig von zunehmender Bedeutung sein wird.

Quote

Citation style:

Hameier, Dorthe: Evaluierung der Anwendbarkeit quantitativer Genexpressionsanalysen an formalinfixiertem, paraffineingebettetem Gewebe. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

Rights

Use and reproduction:
All rights reserved

Export