Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Beurteilung der Wirksamkeit einer Enzymsubstitution am Modell des pankreasgangligierten Minischweins mittels unterschiedlicher Methoden bzw. Parameter (Nährstoffverdaulichkeit, Konzentration absorbierter Nährstoffe sowie unterschiedlicher Testsubstanzen im Blut)

Karthoff, Jeannine

This study is a continuation of a research project which has been running for several years, concerned with the effects of enzyme substitution in pancreatic exocrine insufficiency. For the first time an investigation has been made of other possible ways to quantify the effectiveness of supplementary enzymes, without the need for collection and analysis of   chyme or faeces. For this the following methods were used: ·        Determination of  nutrient digestibility (precaecal / in toto) ·        Determination of various blood parameters (free fatty acids, triglycerides, vitamin E) ·        Pancreas function test (NBT-PABA-, Malabsorption-blood test)   The studies were performed on 25 adult minipigs. As controls (minipigs without a ligature of the pancreatic duct) four animals were used per group, either with an ileo-caecal reentrant fistula or a chronically implanted venous catheter and another swine. In sixteen pigs the pancreatic duct was ligated and 12 of them were also fitted with an ileo-caecal reentrant fistula, the other four with a chronically implanted venous catheter. In the first part of the study each minipig was fed twice daily with 250 g of a high-fat diet, including chromic oxide as a marker. Two different fat diets were used: the fat sources of diet B were butter powder and soy oil (in % dry matter: crude protein (cp): 19.0; crude fat (cfa): 18.6; crude fiber (cfi): 3.90; organic matter: 97.1; starch: 40.9; sugar: 4.77) and the fat source of diet S was: soy oil only (in % dry matter: cp: 14.9; cfa: 34.9; cfi: 3.95; organic matter: 97.1; starch: 33.4; sugar: 2.90). The faeces were collected for 5 days, while the chyme was collected for 12 hours (daytime) for 3 days. To check the efficiency of the different enzymatic products (multi: NN/N and mono: lipase D/NOVO) the enzymes were added to the diet in different dosages, varied in each of the sequential periods. In the second part of the study the concentration of absorbed nutrients (triglycerides, free fatty acids and vitamins) in the serum was determined at different times after feeding: in the control group (0, 90, 180, 210, 270, and 390 min. ppr.) and P1-pigs with and without enzymes (90/210 min ppr.) In the third part of the study two different methods were used to determine pancreatic function. NBT-PABA-Test The NBT-PABA-test shows, in contrast to the parameters determined before, the proteolytic activity. The animals received as a test meal 500 ml or 200 ml of the enteral tube feed Fresubin diabetes® including the test substance NBT-PABA (1 g) / PABA (0.322 g). In this study also, different kinds and dosages of enzymes were added. The other meals consisted of 250 g of a complete diet with the following nutrients in % dry matter: cp: 20.2; cfa: 9.01; cfi: 4.46; organic matter: 97.1; starch: 49.2; sugar: 4.73. Fresubin diabetes® on the other hand, according to the package, contains: per 100 ml: 377 KJ; protein: 3.4 g; carbohydrates: 12 g; fat: 3.2 g. The blood withdrawals from the control group and the P1-pigs took place every hour for 6 hours on three successive days. Malabsorption-blood-test The Malabsorption-blood-test permits a statement about the lipolytic activity since the administered test substance (THA: C17-Triglyceride) must be hydrolysed before absorption. The application of the test substances (C15/C17 or THA) was done with the same test meal (Fresubin diabetes®) as used for the NBT-PABA-test. The blood withdrawal was done hourly for 8 hours after offering and receiving the test food. A minimum period of 48 hours was allowed between tests.   The following analyses were made: crude nutrients (Weender analysis); starch (polarimetry); sugar (gravimetric); Cr2O3 (photometric); pH-value (pH-meter); FFS (enzymatic colour test); triglyceride (enzymatic colour test); tocopherol (HPLC); PABA (photometry); MB-test (gas chromatograph identification of the methyl ester of C15 and C17. The results can be summarized as follows: In comparison to the multi-enzyme product N, the multi-enzyme product NN caused an increase (partly tendency, partly statistically significant) in the total digestibility (VQ in %) of the organic matter and the crude fat. Effects of both multi-enzyme product (N/NN) on total digestibility (%) and crude fat in pancreatic duct ligated pigs fed two diets (mean results):   Pl-0 Pl-24 N Pl-24 NN VQ organic matter Diet-B 69 87 89 Diet-S 61 79 86 VQ crude fat Diet-B 22 79 84 Diet-S 29 64 79   The application of monolipase (D/NOVO) caused the following total digestibility values: organic matter: 71/66 %; crude fat: 54/43 %. 2.      The monolipase D was superior (partially significantly) to NOVO lipase both regarding total digestibility and in the precaecal digestibility of crude fat (VQcfa total: 54/43 %; VQcfa precaecal: 45/31 %). 3.      The evaluation of different enzyme products or dosages on the basis of the concentration of triglycerides and free fatty acids in the serum was not possible, because of the large variation (even in the control group). 4.      The determination of the vitamin E content in the serum in animals fed identical amounts of vitamin E allowed a differentiation between the control group (2.38 µg/ml) and Pl-0 pigs (0.52 µg/ml). Although the level of the control group was not reached after 24 capsules NN, it was nevertheless possible to observe a significant rise (~50 %) of the vitamin E concentration compared to the P1-0 pigs. 5.      It could be proven by the PABA-absorption test, that the low PABA concentration in the serum after oral application of NBT-PABA was caused by a lack of cleavage of the NBT-PABA and not by a lack of absorption. The determination of PABA-concentration in the serum after oral application of NBT-PABA allowed a clear differentiation of the control group (AUC: 538 ± 158) and Pl-0 pigs (AUC: 33.7 ± 21.0) at every time point. Additionally an evaluation of different enzyme products and dosages was possible due to the calculation of the AUC (24N: 444 ± 145; 24NN 706 ± 98; 80N: 470 ± 155; 80NN: 818 ± 129). Moreover, such a differentiation concerning chronological concentration changes was shown mainly during the first 3 hours  During this time a determination of the onset of action was also possible via estimation of the PABA-maximum in the serum (24N (180 Min. ppr.): 166 ± 95.4; 24NN (60 Min. ppr.): 312 ± 49.9). 6.      Neither diagnosis of a pancreatic exocrine insufficiency nor evaluation of different enzyme products and dosages were possible with parallel application of  C15 and C17-THA in the enteral tube feed used, since some 90% of the administered C17-THA was excreted in the faeces and absorption was far lower than expected.   To quantify the efficiency of various enzyme products and dosages, the determination of the nutrient digestibility (precaecal/in toto) cannot be abandoned yet. On the basis of the results of this thesis, both the NBT-PABA-test and the determination of vitamin E concentration in the serum can be used as an interesting alternative and / or addition to the determination of precaecal digestibility. Concerning the NBT-PABA-tests a more frequent blood withdrawal within the first 180 min. post administration seems to be advisable to determine the onset of action. Concerning the Malabsorption-blood-test another test meal might be more appropriate. Moreover, the form of offering the test substances should be revised.

Die vorliegende Arbeit ist als Fortführung eines seit mehreren Jahren laufenden Forschungsprojektes zur Enzymtherapie der exokrinen Pankreasinsuffizienz zu verstehen. Erstmals sollte eine Prüfung zusätzlicher Möglichkeiten erfolgen, die Wirksamkeit supplementierter Enzyme zu quantifizieren, ohne dass hierfür Chymus- oder Kotkollektionen und deren Analysen notwendig sind. Dafür wurden folgende Methoden angewendet: ·        Bestimmung der Nährstoffverdaulichkeit (praecaecal / in toto) ·        Bestimmung unterschiedlicher Blutparameter (freie Fettsäuren, Triglyceride, Vitamin E) ·        Pankreasfunktionsdiagnostik (NBT-PABA-, Malabsorptions-Blut-Test)   Für die Untersuchung standen insgesamt 25 adulte Göttinger Minischweine zur Verfügung. Als Kontrolltiere (ohne Ligatur des Pankreasganges) konnten je vier Tiere mit ileocaecaler Umleitungsfistel bzw. einem Venenverweilkatheter sowie ein weiteres Tier genutzt werden. Bei 16 Tieren war der Pankreasgang ligiert, 12 dieser Tiere waren  mit  einer ileocaecalen Umleitungsfistel und vier Tiere mit einem Venenverweilkatheter ausgestattet. Im ersten Versuchsabschnitt erhielt jedes Tier zweimal täglich 250 g einer fettreichen Diät, incl. eines Indikators (Chromoxid), der Fettanteil der Diät-B stammte aus Butterpulver und Sojaöl (Diät-B; % der TS: Rp: 19,0; Rfe: 18,6; Rfa: 3,90; oS: 97,1; Stärke: 40,9; Zucker: 4,77) während in der Diät-S nur Sojaöl als Fettquelle verwendet wurde (Diät-S; % der TS: Rp: 14,9; Rfe: 34,9; Rfa: 3,95; oS: 97,1; Stärke: 33,4; Zucker: 2,90). Die Kotsammlung erfolgte über 5 Tage, während an 3 Tagen über jeweils 12 Std. (tagsüber) der Chymus gesammelt wurde. Um die Effizienz der unterschiedlichen Multienzymprodukte N/NN bzw. Monoenzymprodukte (Lipase D/NOVO) zu überprüfen, wurden die Enzyme in aufeinanderfolgenden Perioden in unterschiedlichen Dosierungen dem Futter zugefügt. Im zweiten Versuchsabschnitt erfolgte zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Fütterung bei den Kontrolltieren (0, 90, 180, 210, 270 und 390 Min ppr.) und den Pl-Tieren (90/210 Min. ppr.) ohne bzw. mit Enzymzulage die Bestimmung der Konzentration absorbierter Nährstoffe (Triglyceride, freie Fettsäuren und Vit. E) im Serum. Im dritten Versuchsabschnitt kamen zwei unterschiedliche Methoden zur Bestimmung der Pankreasfunktion zum Einsatz: NBT-PABA-Test Der NBT-PABA-Test erlaubt im Unterschied zu den zuvor ermittelten Parametern, eine Aussage über die proteolytische Aktivität. Die Tiere erhielten als Testmahlzeit 500 ml bzw. 200 ml der Sondennahrung Fresubin diabetes® incl. der Testsubstanz NBT-PABA (1 g) / PABA (0,322 g). Auch hier erfolgte eine Zulage unterschiedlicher Enzymprodukte und -dosierungen. Die weiteren Mahlzeiten bestanden aus 250 g eines Alleinfuttermittels, dieses wies folgende Nährstoffgehalte in % der TS auf: Rp: 20,2; Rfe: 9,01; Rfa: 4,46; oS: 97,1; Stärke: 49,2; Zucker: 4,73, während Fresubin diabetes® laut Herstellerangaben je 100 ml, 377 KJ; Eiweiß: 3,4 g; Kohlenhydrate: 12 g; Fett: 3,2 g enthielt. Die Blutentnahme erfolgte an drei aufeinanderfolgenden Tagen im Abstand von 60 Min. ppr. über einen Zeitraum von 6 Std. bei den Kontroll- und Pl-Tieren. Malabsorptions-Blut-Test Der Malabsorptions-Blut-Test erlaubt einen Rückschluss auf die lipolytische Aktivität, da die applizierte Testsubstanz (THA:C17-Triglycerid) vor der Resorption hydrolysiert werden muss. Die Applikation der Testsubstanzen (C15/C17 bzw. THA) erfolgte mit der Sondennahrung Fresubin diabetes®. Die Blutentnahme erfolgte stündlich nach Angebot und Aufnahme der Testmahlzeit, über einen Zeitraum von 8 Std., wobei ein Zeitintervall zwischen den Versuchen von mind. 48 Std. eingehalten wurde.   Analysen: Rohnährstoffe (Weender Analyse); Stärke (Polarimetrie); Zucker (Gravimetrie); Cr2O3 (Photometrie); pH-Wert (pH-Meter); FFS (enzymatischer Farbtest); Triglyceride (enzymatischer Farbtest); Tocopherol (HPLC); PABA (Photometrie); MB-Test (gaschroma-tographischer Nachweis der Methylester von C15 und C17). Die Ergebnisse lassen sich wie folgt zusammenfassen: 1.      Das Multienzymprodukt NN bewirkte, im Vergleich zu dem Multienzymprodukt N stets eine tendenzielle, zum Teil sogar signifikante Steigerung der Gesamtverdaulich-keit (VQ in %) der organischen Substanz und des Rohfettes. Effekte der beiden Multienzympräparate (N/NN) auf die Gesamtverdaulichkeit (%) von organischer Substanz und Rohfett bei Pl-Tieren bei Einsatz zweier Diäten (B/S):   Pl-0 Pl-24 N Pl-24 NN VQoS Diät-B 69 87 89 Diät-S 61 79 86 VQRfe Diät-B 22 79 84 Diät-S 29 64 79 Die beiden Monolipasen  D bzw. NOVO führten zu Verdaulichkeiten der organischen Substanz von 71 bzw. 66 % und des Rohfettes von 54 bzw. 43 %. 2.      Die Monolipase D erwies sich sowohl in der Gesamtverdaulichkeit, als auch in der praecaecalen Verdaulichkeit hinsichtlich der Rohfettverdaulichkeit der Lipase NOVO tendenziell bzw. signifikant überlegen (VQRfe Gesamt: 54/43 %; VQRfe praecaecal: 45/31 % (D/NOVO)). 3.      Die Beurteilung unterschiedlicher Enzymprodukte bzw. -dosierungen anhand der Konzentration von Triglyceriden und freien Fettsäuren im Serum war nicht möglich, insbesondere wegen der in jeder Gruppe (auch Kontrolle) erheblichen Variation der Konzentrationen. 4.      Die Bestimmung des Vit. E-Gehaltes im Serum ermöglicht bei identischer Vitamin E-Aufnahme eine Differenzierung von Kontrolltieren (2,38 µg/ml) und Pl-0 Tieren (0,52 µg/ml). Obwohl nach erfolgter Enzymzulage von 24 Kapseln NN das Niveau der Kontrolltiere nicht erreicht wurde, konnte dennoch ein signifikanter Anstieg (~50 %) der Vit. E-Konzentration im Vergleich zu den Pl-0 Tieren beobachtet werden. 5.      Durch den PABA-Resorptionstest konnte nachgewiesen werden, dass die geringe PABA-Konzentration im Serum nach oraler Applikation von NBT-PABA auf eine mangelnde Spaltung des NBT-PABAs und nicht auf eine mangelnde Resorption zurückzuführen ist. Auch die Bestimmung der PABA-Konzentration im Serum nach oraler Aufnahme des NBT-PABAs ermöglichte die eindeutige Differenzierung zwischen Kontroll- (AUC: 538 ± 158) und Pl-0 Tieren (AUC: 33,7 ± 21,0).  Auch war eine Beurteilung unterschiedlicher Enzymprodukte und –dosierungen durch die AUC möglich (24 N: 444 ± 145; 24 NN: 706 ± 97,2; 80 N: 470 ± 155; 80 NN: 818 ± 129), wenn die Pl-Tiere entsprechend substituiert wurden. Diese Differenzierung war vornehmlich innerhalb der ersten 3 Std. ppr. zu erkennen. In demselben Zeitraum war außerdem eine Bestimmung des Wirkungseintrittes, durch den Nachweis des PABA-Maximums im Serum möglich (24 N (180 Min. ppr.): 166 ± 95,4; 24 NN (60 Min. ppr.): 312 ± 49,9). 6.      Eine Beurteilung einer vorliegenden Pankreasinsuffizienz bzw. unterschiedlicher Enzymprodukte oder -dosierungen war bei paralleler Applikation von C15 und C17-THA) mit der Sondennahrung nicht möglich, da das THA-C17 zu etwa 89,9 % faekal ausgeschieden wurde, so dass eine Resorption weit unterhalb der erwarteten Werte blieb.   Zur Quantifizierung der Wirksamkeit unterschiedlicher Enzymprodukte und –dosierungen kann auch nach diesen Untersuchungen auf die Bestimmung der Nährstoffverdaulichkeit (pracaecal/in toto) noch nicht verzichtet werden. Ausgehend von den Ergebnissen dieser Arbeit zur Wirksamkeitsüberprüfung von Enzymen ohne Chymus- oder Faecaesanalysen kann sowohl der NBT-PABA-Test als auch die Bestimmung der Vit. E-Konzentration im Serum als eine interessante Alternative bzw. Ergänzung zur Bestimmung der praecaecalen Nährstoffverdaulichkeit angesehen werden. Bezüglich des NBT-PABA-Tests sollte zur Bestimmung des Wirkungseintrittes eine häufigere Blutentnahme in den ersten 180 Min. ppr. erfolgen. Bezüglich des Malabsorptions-Blut-Tests erscheint es sinnvoll eine andere Testmahlzeit zu verwenden, auch bedarf die Darreichungsform der Testsubstanzen einer besonderen Entwicklungsarbeit.

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Karthoff, Jeannine: Beurteilung der Wirksamkeit einer Enzymsubstitution am Modell des pankreasgangligierten Minischweins mittels unterschiedlicher Methoden bzw. Parameter (Nährstoffverdaulichkeit, Konzentration absorbierter Nährstoffe sowie unterschiedlicher Testsubstanzen im Blut). Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

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