Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Durchflusszytometrische Differenzierung sowie phänotypische und funktionelle Eigenschaften boviner Milchzellen unter Berücksichtigung der Eutergesundheit

Köß, Cordula

apart from the somatic cell count, the diagnosis of subclinical mastitis also includes the differential cell count of quarter milk samples. A microscopic differentiation is usually time-consuming and its precision depends heavily on the experience of the technician. Flow cytometry is a new method that has been evaluated for its ability of differentiating somatic cells in milk. This method is supposed to produce precise cell differentiations in a relatively short time that allow clear statements regarding the udder health status and the stage of a given inflammation. In the present study, the udder health was categorised observing criteria of microbiology, cytology and somatic cell count. Differential cell counts (analysed with different methods) and cytological function analyses were evaluated considering the udder health status. In order to improve the flow cytometry cell differentiation of the most abundant cell populations, i.e. lymphocytes, PMN and macrophages, mononuclear antibodies were used in the first place. The results obtained for macrophages varied from the data of the literature. It is not possible to identify these phagocytes properly in a flow cytometry dot plot since their size and granularity vary considerably due to their phagocytic activity. Using the method developed for this study however, the position of macrophages within the flow cytometry dot plot according to different cell counts could be established. It was furthermore found out that necrotic PMN can amount to 45 % of the somatic cells. Cell differential counts of bovine somatic cells in milk by flow cytometry that truly represent the udder health status are feasible when the method developed here is applied. With it and unlike microscopy, vital PMN can be differentiated from necrotic ones. The ratio of vital : necrotic cells provides information about the stage of the inflammation and possible successes in therapy; acute inflammations present up to 80 % of vital PMN while this percentage decreases as healing progresses. Interactions between cell ratios and functionality of macrophages and immune mediators of the udder can be established by identifying monocytes and macrophages in flow cytometry. This provides the opportunity to develop drugs to stimulate specifically the cellular defences. This study was furthermore intended to develop a quick method that enables a swift and precise way of using flow cytometry to differentiate somatic cells. Based on the literature, the paper by DOSOGNE et al. (2003) was taken for reference; this paper used low-cell count milk (≤ 200,000 cells/ml). This method resulted inefficient when working with samples with higher cell counts, because, unlike microscopy, the percentage of PMN in severely diseased quarters did not surpass 50 %.  Using more sample material and increasing the acceleration (1000 x g) as well as applying several washings lead to PMN percentages of up to 80 % in high-cell count samples and a better differentiation between healthy quarters and diseased ones. A detailed description on sample volume and centrifugation remains unpublished in order to create a complete and meaningful method that allows a rapid differentiation of cells. It has been observed that the immunological reactions in healthy quarters from diseased udders differ from those of healthy quarters from healthy glands. Cell differential counts were analysed to evaluate this phenomenon. However, these parameters did not yield significant evidence for it. The data obtained in the present study suggests that the immunological defence mechanisms become activated at a cell count already below 100,000 cells/ml. Increases in vital PMN in milk of infected quarters were observed from a cell count level of 75,000 cell/ml on. The percentages of vital PMN in non-infected and infected quarters amounted to 14.51 % and 27.77 %, respectively. The corresponding values for total PMN (vital and necrotic) were 24.15 % and 39.90 %. Differential cell counting and analysis of phenotypes and functions of bovine somatic cells in milk were also evaluated in a progressive study. The general advantage flow cytometry offers in comparison to microscopical differentiation is that vital cells may be differentiated from necrotic ones. Furthermore it was possible to corroborate literature data claiming that the expression density of CD11b and IL-A 110 in milk of diseased quarters ranged well above the values found in healthy ones. An interaction between CD11b expression on PMN and their activity is thought to exist, because phagocytosis of these granulocytes increased with increasing expression of the surface antigen. Further analysis was focused on the interaction between the udder health and the amounts of CD4+ and CD8+ lymphocytes as well as apoptotic and necrotic cells to contribute to a better understanding of the complex immunological mechanisms in the bovine mammary gland.

Die Diagnostik subklinischer Mastitiden schließt neben dem Zellgehalt auch das Zelldifferentialbild von Viertelgemelken mit ein. Eine mikroskopische Differenzierung ist zeitaufwändig und die Präzision hängt stark vom Erfahrungswert des Untersuchers ab. Eine neue Methode, die seit einigen Jahren auf ihre Tauglichkeit zur Differenzierung somatischer Zellen in Milch überprüft wird, ist die Durchflusszytometrie. Sie verspricht eine schnelle und genaue Ermittlung des Zelldifferentialbildes, das Auskunft über den Eutergesundheitsstatus und das Alter etwaiger Entzündungen geben kann. In der vorliegenden Arbeit wurde die Eutergesundheit mit Hilfe mikrobiologischer und zytologischer Befunde kategorisiert. Zelldifferentialbilder, mit unterschiedlichen Methoden analysiert, und zytologische Funktionsanalysen wurden unter Berücksichtigung des Eutergesundheitsstatus evaluiert. Zur Verbesserung der durchflusszytometrischen Zelldifferenzierung der am häufigsten vorkommenden Zellpopulationen Lymphozyten, PMN und Makrophagen wurden zunächst monoklonale Antikörper eingesetzt. Im Hinblick auf die Makrophagen zeigten die eigenen Ergebnisse Diskrepanzen zu Literaturangaben. Diese Phagozyten sind in einem durchflusszytometrischen Dotplot nicht zweifelsfrei zu identifizieren, da ihre Größe und Granularität aufgrund der starken Phagozytoseaktivität erheblich variiert. Mit der selbst erarbeiteten Methodik ist es gelungen, die Position der Makrophagen im durchflusszytometrischen Punktdiagramm für unterschiedliche Zellgehalte der Milch zu präzisieren. Es wurde außerdem festgestellt, dass nekrotische PMN einen hohen Anteil (bis zu 45 %) an somatischen Zellen ausmachen und in der Durchflusszytometrie mit Makrophagen verwechselt werden können. Die vorgeschlagene Technik ermöglicht es, durchflusszytometrisch ein Zelldifferentialbild boviner Milchzellen zu erstellen, dass auf den Eutergesundheitsstatus schließen lässt. Durch dieses Verfahren können  im Gegensatz zur Mikroskopie vitale von nekrotischen PMN abgegrenzt werden. Anhand des Verhältnisses vitaler zu nekrotischen Zellen ist eine Aussage über das Alter der Entzündung und über Therapieerfolge möglich; in akuten Entzündungen lassen sich bis zu 80 % vitale PMN nachweisen, während in der Heilungsphase der Anteil an diesen Zellen immer geringer wird. Über die Identifizierung von Monozyten und Makrophagen im Durchflusszytometer können Zusammenhänge zwischen prozentualen Anteilen und Funktionalität von Makrophagen und Immunmediatoren der Milchdrüse hergestellt werden. Hiermit eröffnen sich Ansätze, Therapeutika zu entwickeln, die spezifisch das zellulär-immunologisch Abwehrgeschehen fördern können. Desweiteren sollte mit Hilfe von Literaturangaben eine Schnellmethode entwickelt werden, die eine rasche und präzise Methode zur durchflusszytometrischen Zelldifferenzierung sicherstellt. Als Referenz wurde insbesondere eine Veröffentlichung von DOSOGNE et al. (2003) herangezogen, in der als Substrat niedrigzellige Milchen (Zellgehalt ≤ 200.000/ml) untersucht wurde.  Es stellte sich heraus, dass dieses Verfahren für höherzellige Proben nicht ausreicht, da im Gegensatz zur mikroskopischen Differenzierung in hochgradig erkrankten Vierteln der Anteil an PMN 50 % nicht überstieg. Ein größeres Probenvolumen zusammen mit einer höheren Beschleunigung (1000 x g) sowie mehreren Waschgängen führte zu einem Anteil an PMN von bis zu 80 % in hochzelligen Milchproben sowie zu einer besseren Abgrenzbarkeit gesunder Viertel von kranken Drüsenkomplexen. Eine detaillierte Arbeitsvorschrift zu Probenvolumen und Zentrifugation steht noch aus, um eine aussagekräftige Methode zu entwickeln, die eine schnelle Differenzierung ermöglicht. Die in einigen Untersuchungen beschriebene Beeinflussung der  immunologischen Reaktionen gesunder Viertel euterkranker Kühe wurde anhand der erhaltenen Zelldifferentialbilder überprüft. Diese Parameter ließen jedoch keine statistisch signifikanten Zusammenhänge zwischen gesunden Vierteln gesunder Kühe und gesunden Vierteln kranker Kühe erkennen. Die vorliegende Arbeit liefert Anhaltspunkte dafür, dass die immunologische Abwehr bereits unterhalb eines Zellgehalts von 100.000/ml Milch aktiviert wird. Oberhalb eines Zellzahlniveaus von 75.000/ml war der Anteil an PMN in der Milch infizierter Viertel im Vergleich zu gesunden Drüsenkomplexen erhöht. Die Prozentanteile für vitale PMN in nicht infizierten Vierteln beliefen sich auf 14,51 % bzw. 27,77 % in infizierten Vierteln. Die korrespondierenden Werte für die Gesamtheit an PMN (vital und nekrotisch) betrugen 24,15 % bzw. 39,90 %. In einer Verlaufsuntersuchung wurden Zelldifferentialbilder sowie Untersuchungen zu Phänotypie und Funktionen boviner Milchzellen durchgeführt. Der Vorteil der durchflusszytometrischen gegenüber der mikroskopischen Zelldifferenzierung bestand darin, dass vitale von nekrotischen Zellen abgegrenzt werden konnten. Außerdem stellte sich heraus, dass in Milch erkrankter Euterviertel die Expressionsdichte von CD11b und IL-A 110 oberhalb der Werte gesunder Drüsenkomplexe lagen. Ein Zusammenhang zwischen Ausprägung von CD11b auf PMN und ihrer Aktivität deutete sich an, denn mit stärkerer Expression des Oberflächenantigens war eine vermehrte Phagozytoseaktivität dieser Granulozyten messbar. Zudem wurden Beziehungen zwischen Eutergesundheit und Anteilen an CD4+- und CD8+-Lymphozyten sowie apoptotischen und nekrotischen Zellen analysiert und leisteten einen Beitrag zum Verständnis der komplexen immunologischen Vorgänge der bovinen Milchdrüse.

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Köß, Cordula: Durchflusszytometrische Differenzierung sowie phänotypische und funktionelle Eigenschaften boviner Milchzellen unter Berücksichtigung der Eutergesundheit. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

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