Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Einfluss von Verdünnerkomponenten auf die Flüssigkonservierung von Schweinesperma

Xuyến, Lê Thị

Experiments to investigate effects of different media-specific substances on the preservation efficiency of liquid boar semen were conducted. A total of 151 ejaculates from 6 institute owned boars were used. Spermatological parameters were motility, integrity of the acrosome and viability (PI). Substances to be examined were components of routinely used extenders, as glucose, bicarbonate-citrate and EDTA, furthermore antioxidative substances, as Trolox, Vit. E and acetylcystein. Finally a experimental substance was tested, which is believed to alter membrane fluidity. In initial experiments the capacitation inducing substance bicarbonate was examined, which is a component of most routinely used dilution media for fresh boar semen. It could be shown, that, based on the above mentioned semen parameter, the bicarbonate-citrate buffer did not show in usual concentrations under normal preservation conditions any capacitation inducing effect over a 9 days storage period. It is obvious that the membrane destabilizing effect of bicarbonate, shown in washed spermatozoa, is inhibited by the presence of EDTA, which as a chelating substance is used in all routine extenders, preventing the influx of Ca2+, which is understood as a signal for the initiation of capacitation, ending in the acrosome reaction. The experimental substitution of bicarbonate in the extender by Tris was problematical, as pH shifts occurred, so that bicarbonate as a basic buffer substance was used in the further experiment. The incorporation of antioxidative substances, as Trolox and -Tocopherol (Vit. E), had the problem of dissolution. Also when ethanol was used, no significant effect on sperm quality could be seen. The use of the water soluble acetylcystein (NAC) showed more success, insofar as a motility enhancing effect was detected. In consequence of a very low pH of 1,5 to 2,0 of NAC the experimental media were adjusted to pH over 7 by adding more bicarbonate. As at increasing concentrations of NAC sperm toxic effects could be detected, the routine use of this substance is questionable since no fertility results are available at the moment. Boar spermatozoa show a pronounced sensibility after cooling below +15 °C, so that preservation at these temperatures is associated with lower sperm quality and fertilizing capacity. This is true for the temperature range between +15 °C and 0 °C as much more when boar spermatozoa are frozen and thawed. The cool shock sensibility is reduced when sperm suspensions are preincubated some hours before cooling down below +15 °C. In pre-experiments of this paper could be confirmed, that cooling without preincubation had a deleterious effect on sperm parameters. In all following experiments therefore a two hours holding time above +15 °C was intercalated, before semen samples were cooled to +10 °C, which resulted in a partial lowering of the cool shock effect on the parameter investigated. The addition of a membrane active substance could increase this partial cool shock-lowering effect significantly. The hypothetical explanation of the protecting effect is based on an increase of membrane fluidity, which on the other hand is believed to stimulate a premature initiation of maturational processes, leading to capacitation and acrosome reaction. Further experiments are therefore essential, considering not only spermatological but also fertilization trials, before a use in practise can be recommended.

Gegenstand der Arbeit war, Einflussfaktoren von Verdünnermedien auf die Konservierbarkeit von Eberflüssigsperma experimentell zu bearbeiten, um eine Verbesserung der Aufrechterhaltung der Befruchtungsfähigkeit zu erreichen. Dabei wurden zunächst in der Praxis übliche Verdünnerkomponenten, wie Glukose, Bikarbonat-Zitrat und EDTA, in ihrer Auswirkung auf die Spermienqualität untersucht, des weiteren Antioxidantien (Trolox, Vitamin E, Acetylcystein) sowie Versuchssubstanzen zur Veränderung der Membranfluidität eingesetzt. Als spermatologische Parameter dienten subjektiv geschätzte Motilität, Akrosomintegrität sowie Viabilität (PI). Die Versuche wurden an insgesamt 151 Ejakulaten von 6 Versuchsebern des Institutes durchgeführt. Zunächst wurde die Wirkung des als kapazitationsinduzierend wirkenden Bikarbonates untersucht, das als Bestandteil von routinemäßigen Puffermedien verwendet wird. Es zeigte sich, dass ein Bikarbonat-Zitrat-Puffer in den üblichen Konzentrationen unter Konservierungsbedingungen keine Akrosomreaktion induzierende Wirkung aufweist. Offensichtlich wird der an gewaschenen Spermien sichtbare membrandestabilisierende Effekt von Bikarbonat unter Konservierungsbedingungen durch das stets im Medium vorhandene EDTA als Chelatbildner verhindert, indem kein Ca2+-Einstrom in die Spermienzellen erfolgt, der als Signal für eine beginnende Kapazitation angesehen wird, die schlussendlich in eine Akrosomreaktion mündet. Die im Rahmen dieser Versuche überprüfte Substitution durch Tris als Pufferbasis erwies sich als problematisch, so dass bei folgenden Versuchen Bikarbonat als Puffersystem weiter verwendet wurde. Die Inkorporierung von Antioxidantien erwies sich insofern als schwierig, dass die nicht wasserlöslichen Substanzen Trolox und -Tocopherol (Vit. E) auch nach Vorauflösung in Äthanol keine nachweisbare positive Wirkung auf die Spermienqualität zeigten. Die Verwendung des wasserlöslichen Acetylcysteins (NAC) war insofern erfolgreicher, als eine signifikant motilitätsfördernde Wirkung ermittelt werden konnte. Wegen des sehr niedrigen pH-Wertes von NAC (pH 1,5 bis 2,0) erfolgte eine Anhebung auf über pH 7 durch vermehrte Zugabe von Bikarbonat zum Medium. Allerdings ergab sich bei steigenden Konzentrationen von NAC eine spermientoxische Wirkung, die sich in einer verminderten Motilität auswirkte. Da aus der Literatur bisher keine Fertilitätsergebnisse bei Verwendung von NAC bekannt sind, ist eine routinemäßige Anwendung problematisch. Da Eberspermien bei Unterschreiten von +15 °C extrem empfindlich gegenüber Kühlschock sind, ist eine Konservierung unterhalb dieser Temperatur mit einer signifikanten Verminderung der Samenqualität und Befruchtungsfähigkeit verbunden. Dieses gilt sowohl für einen Temperaturbereich zwischen +15 °C und 0 °C als noch verstärkt für tiefgefrorenes Ebersperma. Die Kühlschockanfälligkeit wird vermindert durch eine Vorinkubierung des verdünnten Spermas für wenige Stunden bei Temperaturen oberhalb +15 °C, so dass diese zeitabhängige Veränderung bei Versuchen zur Verminderung der Kühlanfälligkeit besonders zu berücksichtigen ist. In Vorversuchen zeigte sich, dass eine Abkühlung ohne Vorinkubation zu einem dramatischen Abfall der Spermienqualität führte. In weiterführenden Versuchen wurde daher stets mit einer zweistündigen Vorinkubation oberhalb +15 °C gearbeitet, bevor die Samenproben auf +10 °C abgekühlt wurden, welches zu einer partiellen Verbesserung der Kühlresistenz führte. Der Zusatz membranwirksamer Moleküle zeigte eine signifikante Verbesserung der Motilitätswerte. Die hypothetische Erklärung der Wirkmechanismen basiert auf einer Veränderung der Membranfluidität, die zu einer verbesserten Resistenz gegenüber Abkühlvorgängen führen soll, jedoch gleichzeitig das Risiko eines vorzeitigen Eintrittes der Kapazitation beinhaltet. Essentiell sind daher weitergehende Untersuchungen, die über eine spermatologische Überprüfung hinausgehen und die Befruchtungsfähigkeit derart behandelter Samenproben untersuchen.

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Xuyến, Lê: Einfluss von Verdünnerkomponenten auf die Flüssigkonservierung von Schweinesperma. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

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