Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Chemoattractants produced by abomasal nematodes in sheep

Reinhardt, Stefanie

The inflammatory reaction to the presence of abomasal nematodes and their products has been examined in two in vivo models, the ovine mammary gland and subcutaneous chambers, as well as in vitro in the micro chemotaxis chamber. An important question being addressed was whether the response to these parasites involved parasite-derived chemotactic substances in addition to the well characterized host-derived chemicals. H. contortus or O. circumcincta E/S products were prepared by incubation of either adult worms or exsheathed L3 in RPMI, HBSS or EBSS. L3 were obtained by culturing eggs from the faecesofinfectedanimalsadultwormswerecollectedfromtheabomasa of infected sheep. They were separated from abomasal contents by setting the contents in 1% agar blocks, which were incubated in a saline bath and the worms collected after their emergence into the saline. Extract preparations of the two parasites were obtained by mechanical disruption. Some E/S products and extracts were concentrated or separated by ultrafiltration through filters of known pore size. Infusion of parasite products into the non-lactating ovine mammary gland caused an influx of cells, predominantly eosinophils. This also proved to be the most successful method for obtaining eosinophil-enriched cell suspensions, with washings containing up to 90 % eosinophils, although these eosinophils had a tendency to adhere to each other and form clumps of cells after migration through the filter when used in the chemotaxis chamber. In contrast, the infusion of parasite products into subcutaneous tissue chambers did not result in a marked eosinophil influx, although there was a significant increase in total leukocyte counts in response to the injections of parasite products. The Micro Chemotaxis Chamber was used to demonstrate the presence of chemotactic factors for both neutrophil and eosinophil granulocytes in E/S products and extracts of H. contortus and O. circumcincta larvae and adults. In several experiments, there was also an indication of chemokinetic activity in some of the parasite products. Overall, the neutrophil chemotactic response was more pronounced than the eosinophil response. From the total of 35 experiments for neutrophil chemotaxis, only 7 did not show positive neutrophil responses. Eosinophil chemotaxis was detected in 20 out of 38 experiments. E/S products of adult H. contortus and O. circumcincta parasites showed a more pronounced chemotactic activity for both neutrophils and eosinophils than larval E/S products. Extracts of L3 and adult worms of both species showed concentration-dependent chemotactic activity for neutrophils and to a lesser extent, for eosinophils. Experiments with fractionated O. circumcincta larval extracts were inconclusive in identifying the chemotactic activity, as it was not limited to one fraction, but was inconsistently present across the whole range of separation products. This could be because the factors are very small molecules, which pass through the pores of all the filters used, or alternatively, they may adhere to bigger proteins and in this way remain in high molecular weight fractions. The possibility that the neutrophil chemotactic factor in O. circumcincta and H. contortus might be of bacterial origin was explored using molecular biological techniques. Molecular probes used to detect bacteria of Wolbachia spp., which are endosymbionts of several filarial nematodes, gave no indication for the presence of these bacteria in H. contortus or O. circumcincta.

Die Nematoden des Labmagens stellen eine bedeutende Gruppe gastrointestinaler Parasiten der Wiederkäuer dar. Bei Schafen sind Infektionen mit Haemonchus contortus und Ostertagia circumcincta besonders verbreitet und führen weltweit zu hohen wirtschaftlichen Verlusten in der Schafproduktion. Eine Hämonchose bzw. Ostertagiose geht einher mit einer parasitären Gastritis, welche zu erheblichen Störungen der Verdauungsvorgänge im Labmagen führen kann. Die Labmagenschleimhaut wird von Entzündungszellen infiltriert, darunter eine große Anzahl neutrophiler und eosinophiler Granulozyten. Sie sind durch die Freisetzung potenter Entzündungsmediatoren und Enzyme maßgeblich an den histopathologischen und pathophysiologischen Veränderungen im Labmagen beteiligt. Es gibt Hinweise darauf, dass neben den wirtseigenen Cytokinen auch von den Parasiten Substanzen gebildet werden, die Leukozyten an den Entzündungsherd locken. Solche direkten Chemotaxine oder Chemoattraktantien für neutrophile und eosinophile Granulozyten wurden bereits in Extrakten bzw. Exkretions- und Sekretionsprodukten (E/S Produkten) verschiedener Parasiten, darunter Ostertagi ostertagi, Ascaris sp. und Onchocerca volvulus, nachgewiesen und als Proteine bzw. Glykoproteine identifiziert. In der hier vorliegenden Arbeit sollte das Vorhandensein und, wenn möglich, der Ursprung und die Struktur derartiger Chemoattraktantien für Granulozyten in Extrakten und E/S Produkten von Larven und adulten H. contortus und O. circumcincta untersucht werden. Adulte Parasiten wurden aus dem Labmagen experimentell infizierter Schafe gewonnen, Drittlarven über in vitro Kultur von Eiern aus den Faeces infizierter Tiere. Durch mechanischen Aufschluss der sogewonnenenParasitenwurdenExtraktehergestelltdasKulturmedium aus der Inkubation von Larven bzw. adulten Parasiten diente als Quelle für E/S Produkte. Mittels Ultrafiltration einiger der so gewonnenen parasitären Produkte durch Filter mit unterschiedlicher Porengröße wurden diese Substanzen gemäß ihres Moleklargewichts fraktioniert und/oder konzentriert. Die Proteinkomposition einiger dieser E/S Präparationen und Extrakte wurde durch Polyacrylamid-Gel Eletrophorese optisch dargestellt. In verschiedenen Filarien, u.a. in Onchocerca volvulus, wurden intrazelluläre endosymbiontische Bakterien der Gattung Wolbachia als Quelle chemotaktischer Substanzen für neutrophile Granulozyten ermittelt. Um der Frage nachzugehen, ob derartige Bakterien auch in H. contortus oder O. circumcincta vorkommen, wurde aus ihren Extrakten DNA isoliert und mittels PCR auf das Vorhandensein bakterieller DNA untersucht. Das chemotaktische Potenzial (Fähigkeit einer Substanz, die aktive, gerichtete Bewegung von Zellen zu beeinflussen) der Extrakte und E/S Produkte wurde in einer Mikro-Chemotaxis-Kammer ermittelt. Bei diesem in vitro Testverfahren wird die Reaktion von Zellen in einer Suspension auf der einen Seite einer porösen Membran auf das potenzielle Chemotaxin in einer Lösung auf der anderen Seite dieser Membran ermittelt, indem nach einer Inkubationszeit die Anzahl der durch die Membran gewanderten Zellen mikroskopisch bestimmt wird. Die für diese Versuche benötigten neutrophilen und eosinophilen Granulozyten wurden aus dem Blut von Schafen isoliert. Es wurden außerdem Verfahren zur selektiven Anreicherung eosinophiler Granulozyten in den Zellsuspensionen erprobt. Als alternative Quellen für Granulozyten wurden Knochenmarks-Zellkulturen und Exsudatzellen, die mittels Injektion von Extrakt in die nicht laktierende Milchdrüse eines Schafes gewonnen wurden, getestet. Diese Methode diente gleichzeitig als Modell für die proinflammatorische Wirkung der Extrakte und E/S Präparationen in vivo. Des weiteren wurden drei Schafen subkutane Kammern implantiert, in denen die chemotaktische Wirkung der parasitären Produkte in vivo ermittelt werden sollte. Als Verfahren zur Gewinnung von granulozytenhaltigen Zellsuspensionen für den Gebrauch in der Mikro-Chemotaxis-Kammer hat sich vor allem die Separation dieser Zellen aus Schafsblut bewährt. Hier wurden routinemäßig Suspensionen mit mehr als 80% Granulozyten, davon bis zu 28% eosinophile Granulozyten, erzielt. Eine weitere Anreicherung dieser Granulozytenfraktion aus Schafsblut war jedoch mit keiner der erprobten Methoden möglich. Die Injektion von Parasitenextrakt in die nicht laktierende Milchdrüse führte zur Ansammlung eines Exsudats mit bis zu 90% eosinophilen Granulozyten. Bei der Anwendung dieser Exsudatzellen in Chemotaxis-Experimenten wurde jedoch festgestellt, dass sie verstärkt aneinander hafteten und zur Klumpenbildung auf dem Filter neigten, was ihre Nutzbarkeit in der Mikro-Chemotaxis-Kammer einschränkte. Die Injektion parasitärer Produkte in die subkutan implantierten Kammern hingegen resultierte nicht in einem verstärkten Einstrom eosinophiler Granulozyten, obwohl sie zu einer signifikanten Erhöhung der Gesamtleukozytenzahl führte. Die in vitro Kultur von Knochenmarkszellen war nicht erfolgreich, weil die vorhandenen Cytokine, die essentiell sind für die Heranreifung der GranulozytennichtdenAnforderungenentsprachenDieinvitro Experimente mit der Mikro-Chemotaxis-Kammer demonstrierten die Präsenz chemotaktischer Substanzen sowohl für neutrophile als auch für eosinophile Granulozyten in Extrakten und E/S Produkten von H. contortus und O. circumcincta Larven und adulten Parasiten. In mehreren Experimenten gab es außerdem Anhaltspunkte für das Vorhandensein von Substanzen mit chemokinetischer Wirkung (die ungerichtete Bewegungsaktivität von Zellen beeinflussend). Insgesamt war die chemotaktische Reaktion neutrophiler Granulozyten stärker ausgeprägt als die eosinophiler Granulozyten. Von den insgesamt 35 Experimenten für neutrophile Chemotaxis waren nur 7 Tests negativ, während eosinophile Chemotaxis in 20 von insgesamt 38 Experimenten nachgewiesen werden konnte. Die E/S Produkte adulter Parasiten hatten eine ausgeprägtere chemotaktische Aktivität sowohl für neutrophile als auch eosinophile Granulozyten als die E/S Produkte von H. contortus und O. circumcincta Larven. Dabei konnte in den meisten Experimenten, in denen verschiedene Verdünnungsstufen der parasitären Produkte getestet wurden, eine Konzentrationsabhängigkeit der chemotaktischen Aktivität für neutrophile und weniger ausgeprägt auch für eosinophile Granulozyten demonstriert werden. Wie auch in der SDS-Gel Elektrophorese gezeigt wurde, war die Trennung der Extrakte und E/S Produkte in Fraktionen mit unterschiedlichem Molekulargewicht mittels Ultrafiltration nur bedingt erfolgreich und es gelang nicht, die chemotaktische Aktivität auf bestimmte Fraktionen einzugrenzen. Es wäre möglich, dass es sich bei den chemotaktischen Faktoren um sehr kleine Moleküle handelt, die die Poren aller verwendeten Filter passieren können oder die an größeren Proteinen haften und so in den Fraktionen höherer Molekulargewichte verbleiben. Die molekularbiologische Untersuchung der aus Parasitenextrakten isolierten DNA ergab keinen Hinweis auf das Vorhandensein von Wolbachia DNA in diesen Proben. Die Möglichkeit, dass andere symbiotische Bakterien in den Parasiten vorhanden und an der Bildung chemotaktischer Faktoren beteiligt sind, ist jedoch nicht auszuschließen. Die Ergebnisse dieser Studie unterstützen die These, dass H. contortus und O. circumcincta, wie für verschiedene andere Parasiten bereits nachgewiesen, Substanzen mit einer direkten chemotaktischen Wirkung auf neutrophile und eosinophile Granulozyten produzieren und durch die Ausscheidung dieser Stoffe für die Akkumulation von Leukozyten im Rahmen der parasitären Gastritis direkt mitverantwortlich sind.

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Reinhardt, Stefanie: Chemoattractants produced by abomasal nematodes in sheep. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

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