Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zum Argininstoffwechsel bei Mycobacterium bovis BCG in vitro und im Infektionsmodell

Sürken, Michael

The causative agent of tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis, is able to persist in its host for years under microaerobic or even anaerobic conditions, even though it is considered to be an obligate aerobe organism. In the genome sequence of M. tuberculosis, a gene with homology to arcA of Pseudomonas aeruginosa was annotated. This gene encodes an arginine deiminase, an enzyme that is part of a pathway (the arginine deiminase pathway, ADI-Pathway) in P. aeruginosa, enabling it to grow under anaerobic conditions. In a previous study, arcA- deletion mutants in M. tuberculosis and M. bovis BCG had been constructed (RÖHKER 2003). The aim of the present study was to characterize the arginine deiminase in vitro and to determine whether further enzymes of the ADI-Pathway are active in M. tuberculosis and M. bovis BCG. Furthermore, it was examined if a deletion of the arcA-gene in M. bovis BCG leads to attenuation in vivo. In the in vitro examinations of this study, the arcA deletion mutants of M. tuberculosis and M. bovis BCG were compared to the wildtype strains under anaerobic and aerobic conditions. Under aerobic conditions, growth with arginine as the sole nitrogen source was analysed. All strains grew under these conditions and no differences in growth between mutants and wildtype strains were observed. Under anaerobic conditions, the ΔarcA mutants were not able to produce ammonia from arginine, in contrast to the wildtype strains. The mutant strains regained this ability by complementation with the arcA-gene of M. tuberculosis. Thus, it can be concluded that arcA in M. tuberculosis and M. bovis BCG mediates arginine deiminase activity. These results also show that the activity mediated by arcA is only present under anaerobic conditions. Besides ammonia, citrulline is another product of the arginine deiminase reaction. Incubated with Citrulline as the sole nitrogen source under anaerobic conditions, the ΔarcA mutants produced ammonia in comparable rates to the wildtype strains. This points out that the enzymes ArcB and ArcC are as well present in M. bovis BCG and M. tuberculosis. It was shown by the in vivo experiments that the ΔarcA-mutant of M. bovis BCG was attenuated in immunocompetent BALB/c-mice. Therefore, the arginine deiminase seems to play a role for persistence in mice. With regards to the long term objective of the development of a new vaccine, a ΔnarG ΔarcA M. tuberculosis double mutant was generated. As expected, it showed neither arginine deiminase activity nor nitrate reductase activity. Whether the attenuation in vivo is amplified by the double mutation has to be subject of further experiments.

Der Erreger der Tuberkulose, Mycobacterium tuberculosis, ist in der Lage, im Wirt unter mikroaeroben bis anaeroben Bedingungen jahrelang zu persistieren, obwohl er als strikt aerobes Bakterium gilt. Bei der Sequenzierung von M. tuberculosis wurde ein Gen annotiert, das Homologien zu arcA von Pseudomonas aeruginosa aufweist. Dieses Gen kodiert für die Arginindeiminase. ein Enzym, das bei P. aeruginosa Teil eines Stoffwechselwegs (Arginindeiminase-Weg), der es dem obligat aeroben Bakterium ermöglicht, unter anaeroben Bedingungen zu wachsen. In einer vorangegangenen Arbeit wurden ΔarcA-Deletionsmutanten in M. tuberculosis und M. bovis BCG erstellt (RÖHKER 2003). Ziel dieser Arbeit war es, die Arginindeiminase in vitro näher zu charakterisieren und festzustellen, ob bei M. tuberculosis und M. bovis BCG neben der Arginindeiminase weitere Enzyme des Arginindeiminasewegs vorhanden sind. Außerdem wurde untersucht, ob eine Deletion des arcA-Gens zu einer Attenuierung von Mycobacterium bovis BCG in vivo führt. In in-vitro-Untersuchungen dieser Arbeit wurden arcA-Deletionsmutanten von M. tuberculosis und M. bovis BCG unter aeroben und anaeroben Bedingungen mit den Wildtypen beider Stämme verglichen. Unter aeroben Bedingungen wurde das Wachstum mit Arginin als alleiniger Stickstoffquelle untersucht. Alle Stämme zeigten Wachstum, es traten keine Unterschiede im Wachstumsverhalten zwischen Wildtypen und Mutanten auf. Unter anaeroben Bedingungen waren die arcA-Deletionsmutanten, im Gegensatz zu den Wildtypen, nicht in der Lage, Ammoniak aus Arginin abzuspalten. Diese Fähigkeit erlangten sie durch eine Komplementation mit dem Wildtyp-Gen wieder. Daraus kann geschlossen werden, dass das arcA-Gen von M. tuberculosis und M. bovis BCG eine Arginindeiminase-Aktivität vermittelt. Außerdem zeigen die Ergebnisse, dass die durch arcA vermittelte Aktivität nur unter anaeroben Bedingungen vorhanden ist. Neben Ammoniak ist Citrullin ein weiteres Abbauprodukt der Arginindeiminase-Reaktion. Mit Citrullin als alleiniger Stickstoffquelle unter anaeroben Bedingungen inkubiert, spalteten die ΔarcA-Mutanten vergleichbare Mengen an Ammoniak aus Citrullin ab wie die Wildtypen. Dies weist darauf hin, dass auch die beiden Enzyme ArcB und ArcC bei M. tuberculosis und M. bovis BCG vorhanden sind. Die abschließenden in vivo-Versuche zeigten, dass die ΔarcA-Mutante von M. bovis BCG gegenüber dem Wildtyp in immunkompetenten BALB/c-Mäusen attenuiert ist. Dies weist darauf hin, dass die Arginindeiminase eine Rolle für die Persistenz in Mäusen spielt. Mit Hinblick auf das langfristige Ziel der Entwicklung eines Impfstoffs wurde durch die Deletion des narG-Gens in der ΔarcA-Mutante von M. tuberculosis eine ΔnarG-ΔarcA-Doppelmutante erzeugt. In vitro zeigte die Doppelmutante wie erwartet weder eine Arginindeiminaseaktivität, noch eine Nitratreduktaseaktivität. Ob sich die Attenuierung in vivo durch die zwei vorliegenden Mutationen potenziert, muss in Infektionsversuchen untersucht werden.

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Sürken, Michael: Untersuchungen zum Argininstoffwechsel bei Mycobacterium bovis BCG in vitro und im Infektionsmodell. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

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