Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Nitratassimilation bei Mykobakterien

Schultze, Sonja

Nitrate assimilation describes a metabolic pathway under nitrogen limited conditions. Many bacteria have the ability to reduce nitrate to nitrite by means of a cytoplasmatic assimilatory nitrate reductase. In subsequent reactions, nitrite is turned into ammonium, amino acids and other nitrogenic cell materials. The first part of the present study focused on the GlnR-Regulator of M. tuberculosis, which is encoded by the gene Rv0818. In bacteria, GlnR regulates the glutamine-synthetase in different ways. However, the function of this regulator in mycobacteria was unknown to date. The aim of this work was to examine the function of GlnR in M. tuberculosis by construction of a glnR deletion mutant. The glnR mutant of M. tuberculosis was not able to grow in the presence of nitrate as the sole nitrogen source. By use of culture medium with glutamine the mutant grew comparable to the wildtype. This leads to the conclusion that the ΔglnR mutant lost its assimilatory capability. The high homologies of the GlnR-Regulator of Streptomyces coelicolor gave a hint to the function of the regulator in M. tuberculosis. Thus, the function of glnR is the upregulation of glutamine synthetase expression under nitrogen limited conditions. The second part of the study was the examination of the assimilatory metabolism of M. smegmatis. Within a chemically mutagenised M. smegmatis strain, we defined the genetically engineered genomic locus of nitrate assimilation. An alignment of the open reading frame revealed an over 80 percent homology to nirB of M. tuberculosis. This gene encodes the assimilatory nitrite reductase of M. tuberculosis. Efforts to complement the M. smegmatis mutant with nirB from M. tuberculosis failed. Vice versa a DnirB mutant of M. tuberculosis was complemented with the gene of M. smegmatis. This leads to the conclusion that the assimilatory nitrite reduction in M. smegmatis is mediated by a nitrate reductase encoded by nirB. Whether the lack of complementation of ΔnirB M. smegmatis by the nirB of M. tuberculosis possibly is due to differences in promoterstructures should be subject of further investigations.

Die Nitratassimilation beschreibt einen Stoffwechselweg, der von vielen Bakterien unter stickstofflimitierten Bedingungen genutzt wird. Dabei wird Nitrat durch eine zytoplasmatische Nitratreduktase zu Nitrit reduziert und über nachfolgende Reaktionsschritte zur Synthese von stickstoffhaltigen Zellkomponenten verwendet. Im ersten Teil dieser Arbeit stand der GlnR-Regulator von M. tuberculosis, der durch das Gen Rv0818 kodiert wird, im Mittelpunkt der Forschungsarbeiten. Bei Bakterien reguliert GlnR die Glutaminsynthetase auf sehr unterschiedliche Weise. Welche Funktion der Regulator bei Mykobakterien hat, war bis zum heutigen Zeitpunkt unbekannt. Ziel dieser Arbeit war, die Funktion von GlnR bei M. tuberculosis durch Erstellung einer glnR-Deletionsmutante zu untersuchen. Funktionsassays dieser Mutante verdeutlichten, dass sie in vitro nicht mehr in der Lage war, auf Nitrat als alleinige Stickstoffquelle zu wachsen. Wurden Nährmedien mit Glutaminzusatz verwendet, zeigte die DglnR-Mutante gleiches Wachstum wie der Wildtyp. Dieses Wachstumsverhalten lässt die Schlussfolgerung zu, dass die DglnR-Mutante ihre assimilatorische Eigenschaft verloren hat. Die hohe Homologie zu dem gut untersuchten GlnR-Regulator von Streptomyces coelicolor ließ auf die Funktion des Regulator bei M. tuberculosis schließen. Sie ist folglich die vermehrte Expression der Glutaminsynthetase unter stickstofflimitierten Bedingungen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der assimilatorische Metabolismus von M. smegmatis untersucht. Dabei konnte bei einer chemisch mutagenisierten Mutante von M. smegmatis, die nicht mehr zur Nitratassimilation befähigt war, das veränderte Gen eingegrenzt werden. Durch Sequenzvergleich des lokalisierten Gens von M. smegmatis wurde eine über 80%ige Homologie zu dem nirB-Gen von M. tuberculosis festgestellt. Dieses Gen kodiert bei M. tuberculosis die assimilatorische Nitritreduktase. Komplementierungsversuche der M. smegmatis-Mutante mit dem nirB-Gen von M. tuberculosis schlugen fehl. Eine DnirB-Mutante von M. tuberculosis konnte jedoch mit dem eingegrenzten Gen von M. smegmatis erfolgreich komplementiert werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass die assimilatorische Nitritreduktion bei M. smegmatis durch eine nirB-kodierte Nitritreduktase vermittelt wird. Die Frage, ob die fehlende Komplementation der nirB-Mutante von M. smegmatis durch das nirB-Gen von M. tuberculosis die Folge von bspw. unterschiedlichen Promotoren ist, muss durch weiterführende Untersuchungen beantwortet werden.

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Schultze, Sonja: Nitratassimilation bei Mykobakterien. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

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