Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Entwicklung eines ELISA zur Serodiagnose der Leptospirose und einer PCR zum direkten Nachweis des Erregers

Theodoridis, Dimitrios

Leptospirosis is a febrile infectious disease of animals and humans occurring worldwide. In farm animals the infection proceeds mostly asymptomatically and causes high economical losses due to reproductive failure and a drop in productivity. Diagnosis is mainly based on detection by the serological reference method, the Microscopic Agglutination Test (MAT), which has a sensitivity of only 41 %. This thesis describes the development of two methods for the improvement of present diagnostic techniques, namely i) a multi serovar ELISA for serological detection and ii) a PCR specifically detecting pathogenic serovars only. The ELISA is based on the surface exposed outer membrane lipoprotein L41 (LipL41), that occurs only in pathogenic Leptospira and is recognized by convalescent sera. The entire recombinant LipL41 protein (rLipL41-G) and the carboxyterminal half molecule (rLipL41-9) were used as test antigens. The Intra-Assay-Variation was 13 % (rLipL41-G) resp. 5 % (rLipL41-9) and the Inter-Assay-Variation 21 % (rLipL41-G) resp. 16 % (rLipL41‑9). A diagnostic sensitivity (D‑SN) of 81 % (rLipL41-G) resp. 89 % (rLipL41-9) and a diagnostic specificity (D‑SP)of 100% (rLipL41-G and rLipL41-9) could be achieved by ELISA validation with sera of experimentally infected gerbils using the known state of infection as reference. The correlation of MAT- and ELISA-results was very high (rSpearman=0,905 [rLipL41‑G] resp. 0,920 [rLipL41‑9]). Comparative individual animal examination with field sera from pigs with MAT and ELISA showed low correlation (k=0,16 [rLipL41‑G] resp. 0,18 [rLipL41‑9]). In contrast correlation between ELISA and Western-Blot was high (k=0,60 [rLipL41‑G] resp. 0,71 [rLipL41‑9]). Therefore the Western-Blot was used as reference method to determine a cut off value for the pig-ELISA. A D‑SN of 79 % (rLipL41-G) resp. 90 % (rLipL41-9) and a D‑SP of 91 % (rLipL41-G) resp. 90 % (rLipL41-9) could be determined. The ELISA has a D‑SN and D‑SP comparable to that of the MAT for individual animals; combining the ELISA and the MAT can increase the D‑SN to 75 %. The PCR developed is based on the lipL41-gen, that is specific for pathogenic Leptospira. A fast and standardized DNA extraction from different clinical materials was done using a commercially available preparation kit. The reproducible limit of detectability is 10 Leptospira genomes per PCR reaction. An internal control required for the diagnostic use of PCRs allows the exclusion of false negative results.

Die Leptospirose ist eine weltweit auftretende, fieberhafte Infektionskrankheit warmblütiger Tiere und des Menschen. Bei den landwirtschaftlichen Nutztieren verläuft die Infektion meist inapparent und richtet durch Reproduktionsstörungen und Leistungseinbußen erheblichen wirtschaftlichen Schaden an. Die Diagnose stützt sich hauptsächlich auf dem Nachweis mittels Mikroagglutinationstest (MAT), der serologischen Referenzmethode, deren Sensitivität ca. 41 % beträgt. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Methoden zur Verbesserung der derzeitigen diagnostischen Möglichkeiten entwickelt. Dabei handelt es sich einerseits um einen serovarübergreifenden ELISA für den serologischen Nachweis und andererseits um einen Erregernachweis mittels PCR. Der ELISA basiert auf dem oberflächenexponierten Außenmembran-Lipoprotein L41 (LipL41), das nur bei pathogenen Leptospiren vorkommt und von Rekonvaleszentenseren detektiert wird. Das gesamte LipL41-Protein (rLipL41-G) sowie ein aminoterminal verkürztes LipL41-Protein (rLipL41-9) wurden rekombinant hergestellt und als Testantigen eingesetzt. Die Intra-Assay-Variation betrug 13 % (rLipL41-G) bzw. 5 % (rLipL41-9) und die Inter-Assay-Variation 21 % (rLipL41-G) bzw. 16 % (rLipL41-9). Bei der Validierung des ELISA mit Hilfe von Seren experimentell infizierter Gerbils am bekannten Infektionsstatus konnte eine Diagnostik-Sensitivität (D‑SN) von 81 % (rLipL41-G) bzw. 89 % (rLipL41-9) und eine Diagnostik-Spezifität (D‑SP) von 100% (rLipL41-G und rLipL41-9) erzielt werden. Die Korrelation von MAT-und ELISA-Ergebnissen war sehr gut (r=0,905 [rLipL41‑G] bzw. 0,920 [rLipL41‑9]). Die vergleichende Untersuchung mit Feldseren von Schweinen im MAT und ELISA zeigte nur eine schwache Korrelation auf Einzeltierebene (k=0,16 [rLipL41‑G] bzw. 0,18 [rLipL41‑9]). Dagegen war die Korrelation zwischen ELISA und Western-Blot deutlich (k=0,60 [rLipL41‑G]) bzw. stark (k=0,71 [rLipL41‑9]). Daher wurde zur Cut off-Bestimmung des ELISA für die Untersuchung von Schweineseren der Western-Blot als Goldstandard herangezogen. Es konnte eine D‑SN von 79 % (rLipL41-G) bzw. 90 % (rLipL41-9) und eine D‑SP von 91 % (rLipL41-G) bzw. 90 % (rLipL41‑9) ermittelt werden. Der ELISA weist damit für die serologische Einzeltierdiagnose der Leptospirose eine dem MAT vergleichbare D‑SN und D‑SP auf; durch die Kombination von MAT und ELISA kann die D‑SN auf 75 % gesteigert werden. Die entwickelte PCR basiert auf dem für pathogene Leptospiren spezifischen lipL41-Gen. Eine schnelle und standardisierte DNA-Extraktion aus unterschiedlichen Untersuchungsmaterialien wurde mittels eines handelsüblichen Präparationskits ermöglicht. Die reproduzierbare Nachweisgrenze im Reaktionsansatz betrug ca. 10 Leptospiren. Mit einer für den diagnostischen Einsatz von PCRs erforderlichen internen Funktionskontrolle können falsch negative Ergebnisse ausgeschlossen und Handhabungsfehler kontrolliert werden.

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Theodoridis, Dimitrios: Entwicklung eines ELISA zur Serodiagnose der Leptospirose und einer PCR zum direkten Nachweis des Erregers. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

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