Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchung zur Pharmakokinetik des Arzneistoffes Detomidin hinsichtlich der Dopingrelevanz beim Pferd

Tobias, Severine

The aim of this study was to develop and validate a suitable method for the analysis of detomidine in equine plasma and urinesamples and evaluate its application for pharmacocinetic calculations and pharmacodynamic examinations on horses. The analytical method was based upon some established routine procedures at the Institute of Biochemistry at the Deutsche Sporthochschule in Cologne, which were specially modified for the substance detomidine using samples collected in a preliminary study. The horses in the preliminary experiment as well as in the main expermiment received detomidine-hydrochloride in a middle-ranged therapeutical dose of 20 µg/kg body weight intravenously. The detection of detomidine in plasma was performed using a HPLC/MS/MS-method after liquid-liquid-extraction. For the diagnosis of detomidine and its metabolites 3-hydroxydetomidine and carboxydetomidine in urine an additional recondition step using cation-exchange-cartridges was developed. Following evaporation of the liquid volume these samples were prepared for analysis in the HPLC/MS/MS as well. In comparison urinesamples were prepared with or without hydrolysis to determine the unconjugated 3-hydroxy- and carboxydetomidine. Medetomidine and imidazolylbencoicacid were used as internal standards. The validation of the analytical method was performed on the parameters selectivity and specitivity, linearity, accuracy, precision, stability and recovery. The limit of quantification was 2,09 ng/ml in plasma, 10 ng/ml for 3-hydroxydetomidine and 50 ng/ml for carboxydetomidine. The limit of detection was fixed at 1,67 ng/ml in plasma, at 10 ng/ml for 3-hydroxydetomidine and 50 ng/ml for carboxydetomidine. Maximum concentrations of detomidine in plasma were detected 2 to 5 minutes p. a. within the range of 12 and 35 ng/ml plasma. The maximum concentrations for 3- hydroxydetomidine in urine were measured between 3 to 6 hours p. a. and varied between 31 to 130 ng/ml. For carboxydetomidine the highest concentrations ranged from 450 to 1550 ng/ml urine at 5 to 8 hours p. a. Detomidine in plasma samples was detectable for only three hours p. a., while the concentration of 3-hydroxydetomdine and carboxydetomidine were below the limit of detection after 24 and 30 hours respectively. The calculated pharmacocinetic data were integrated into a pharmacocinetic/ pharmacodynamic model of TOUTAIN and LASSOURD (2002) to calculate the effective and irrelevant plasma and urine concentrations. Given a dosage interval of 4 hours within this study, it came clear that irrelevant plasma and urinconcentrations were far below the detection-limit of the analytical method applied in this study. Therefore, it has been concluded that any detection of detomidine or its metabolites has to be considered as a positive dopingresult. Additionally to sampling plasma and urine for the pharmacocinetic approach there were investigated some pharmacodynamic parameters such as heart rate, respiration rate, body temperature, level of sedation and analgesia were recorded and compared to the effective and irrelevant plasma and urine concentrations calculated by the pharmacocinetic/pharmacodynamic model of TOUTAIN and LASSOURD (2002) as well as calculated excretion times. With the opportunity of this study to compare between practically and theoretically investigated data regarding excretion times and pharmacological effects, it was shown that the thoretical calclation is not always comparable to the data achieved in an animal experiment. Due to the fact that every animal experiment has to compromise in the number of animals included, therefore representing only a small part of the population, and with regards to notable individual variation, no defined statement can be made for general excretion times. Thus, every detection of either detomidine or its metabolites can be counted as a positive doping result and should be punished according to the law.

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung und Validierung einer geeigneten Analysemethode für Detomidin in Pferdeplasma- und -urinproben, um pharmako-kinetische Berechnungen sowie pharmakodynamische Untersuchungen an Pferden durchzuführen. Grundlage für die Entwicklung der Methode waren im Institut für Biochemie der Deutschen Sporthochschule Köln etablierte Routineverfahren, die durch in einem Vorversuch gewonnene Proben speziell für Detomidin modifiziert wurden. Sowohl im Vor- als auch im Hauptversuch wurde Pferden Detomidin-Hydrochlorid in einer mittleren therapeutischen Dosierung von 20 µg/kg KM einmalig intravenös appliziert. Der Nachweis von Detomidin im Plasma erfolgte nach einer Flüssig-Flüssig-Extraktion mittels HPLC/MS/MS-Methode. Für die Detektion von Detomidin und seinen Metaboliten 3-Hydroxydetomidin und Carboxydetomidin im Urin wurde eine Aufarbeitung mit Ionenaustauschersäulen entwickelt. Auch diese Proben wurden nach Einengung des Volumens der Messung im HPLC/MS/MS zugeführt. Vergleichsweise wurden Urinproben mit und ohne Hydrolyse aufgearbeitet, um den Anteil an frei ausgeschiedenem 3-Hydroxy- und Carboxydetomidin bestimmen zu können. Als interne Standards wurden Medetomidin und Imidazolylbenzoesäure verwendet. Die Validierung der Methode umfasste die Parameter Selektivität und Spezifität, Linearität, Richtigkeit, Präzision, Stabilität und Wiederfindung. Die Bestimmungsgrenze lag im Plasma bei 2,09 ng/ml und im Urin bei 10 ng/ml für 3-Hydroxydetomidin und 50 ng/ml für Carboxydetomidin. Die Nachweisgrenze fürDetomidin im Plasma betrug 1,67 ng/ml. Für 3-Hydroxydetomidin lag die Nachweisgrenze bei 10 ng/ml und für Carboxydetomidin bei 50 ng/ml. Maximale Konzentrationen von Detomidin im Plasma wurden 2 beziehungsweise 5 Minuten p. a. ermittelt und lagen zwischen 12 und 35 ng/ml Plasma. Die maximalen Konzentration von 3-Hydroxydetomidin wurden mit 31 bis 130 ng/ml Urin 3 bis 6 Stunden p. a. gemessen. Carboxydetomidin erreichte seine höchsten Konzen-trationen von 450 bis 1550 ng/ml Urin im Zeitraum 5 bis 8 Stunden p. a. Die Nachweisgrenze wurde im Plasma nach 3 Stunden, im Urin nach 24 Stunden (3-Hydroxydetomidin) beziehungsweise 30 Stunden (Carboxydetomidin) unterschritten. Die ermittelten pharmakokinetischen Daten wurden zur Berechnung der effektiven beziehungsweise irrelevanten Plasma- und Urinkonzentrationen nach dem PK/PD-Modell von TOUTAIN und LASSOURD (2002) herangezogen. Bei einem angenommenen Dosierungsintervall von vier Stunden liegen die irrelevante Plasma- und Urinkonzentration deutlich unterhalb der Nachweisgrenze für die verwendete Methode. Es ist daher davon auszugehen, dass jeglicher Nachweis von Detomidin oder seinen Metaboliten als positiver Dopingbefund zu bewerten ist. Neben der Gewinnung von Plasma- und Urinproben für die pharmakokinetischen Untersuchungen wurden pharmakodynamische Parameter wie Herz- und Atemfrequenz, Körpertemperatur, Sedationsgrad und Grad der analgetischen Wirkung erfasst und mit den berechneten irrelevanten Plasma- undUrinkonzentrationen nach TOUTAIN und LASSOURD (2002) und zusätzlich berechneten Ausscheidungszeiten verglichen. Durch den in dieser Studie ermöglichten Vergleich zwischen praktischer und theoretischer Ermittlung von Ausscheidungszeiten und pharmakologischen Wirkungen wurde deutlich, dass theoretische Berechnungen der irrelvanten Plasma- und Urinkonzentrationen, sowie verschiedener Ausscheidungszeiten nicht immer mit den im Tierversuch ermittelten Ergebnissen übereinstimmen. Aufgrund der relativ zu Gasamtpopulation noch immer geringen Anzahl von Versuchstieren und beachtenswerter interindividueller Variabilität sollte keine, auf die Gesamtpopulation übertragbare, Aussage zu Ausscheidungszeiten getroffen und jeder Nachweis von Detomidin oder seinenMetaboliten als positiver Dopingbefund betrachtet und geahndet werden.

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Tobias, Severine: Untersuchung zur Pharmakokinetik des Arzneistoffes Detomidin hinsichtlich der Dopingrelevanz beim Pferd. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

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