Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Molekulare Charakterisierung von langsam wachsenden Subpopulationen (small colony variants) von Pseudomonas aeruginosa isoliert aus dem Respirationstrakt von Mukoviszidosepatienten

Wild, Verena

Chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection is the major cause of morbidity and mortality in patients with cystic fibrosis (CF). Although most CF patients are colonised with only one P. aeruginosa clone, the pathogen exhibits a substantial morphotypic diversity in the heterogeneous and ever-changing habitat of the CF lung. Apart from the mucoid P. aeruginosa phenotype whose excessive exopolysaccharide (alginate) production obviously plays a major role in the pathogenesis of CF, it has been recognised that so called small colony variants (SCVs) can be isolated from the respiratory tract of CF patients. The recovery of SCVs correlates with poor lung function parameters and inhaled antibiotic therapy. Another distinct feature of the SCVs was their reversion after several passages in rich medium to a fast growing phenotype. The aim of this study was to identify the molecular mechanism that lead to a phenotypic switch of P. aeruginosa in the CF lung and particularly the emergence of SCVs. Attention was focused on a clinical subgroup of autoaggregative and hyperpiliated SCVs with an increased capability of biofilm formation, which apparently select in the unique environment of the CF lung. With the aim to verify the hypothesis that mutation and selection are the driving forces for morphologic diversity, a transposon mutagenesis of a SCV and wildtype P. aeruginosa strain was carried out. In the wildtype of a clinical P. aeruginosa strain 20 different mutations led to a slow growing phenotype and 11 different mutations in the clonal SCV led to a fast growing phenotype. Among the transposon mutants a substantial diversity in their colony morphology particularly among the slow growing mutants occurred. Nevertheless, it seemed that slow growth and autoaggregation in P. aeruginosa were linked. The characterisation of an autoaggregative and slow growing transposon mutant (25/C1) exhibited an upregulation of the P. aeruginosa chaperone/ usher pathway (cup) genes. Apparently the (cup) genes encode for fimbrial structures on the bacteria surface and their expression may be responsible for the autoaggregative phenotype of P. aeruginosa. The results of this study implicate the expression of the cup genes (and therefore the autoaggregative phenotype of P. aeruginosa) might be positively regulated by proteins with a GGDEF domain, whereas a negative regulation of the cup gene expression in P. aeruginosa be caused by the EAL domain containing phenotype variant regulator (PvrR). The expression of the fimbrial structures on the bacteria surface at P. aruginosa could be influenced by regulator proteins containing a GGDEF domain and EAL domain in an antagonising way. The novel intracellular signal molecule cyclic di-GMP might play a key role in the phenotypic switch of P. aeruginosa.

Pseudomonas aeruginosa trägt bei Patienten mit Cystischer Fibrose (CF) in Form einer chronischen Lungeninfektion maßgeblich zur Morbidität und Mortalität bei. Obwohl die Mehrzahl der Patienten nur mit einem P. aeruginosa-Klon kolonisiert sind, entsteht in dem sehr heterogenen und sich ständig wechselnden Habitat der CF-Lunge eine große morphologische Differenzierung des Erregers. So werden neben dem mukoiden P. aeruginosa-Phänotyp, dessen exzessive Exopolysaccharidbildung (Alginat) eine wichtige Rolle bei der Pathogenese der chronischen Lungeninfektion zugeschrieben wird, so genannte small colony variants (SCVs) aus dem Respirationstrakt von CF-Patienten isoliert. Es konnte gezeigt werden, dass das Auftreten von SCVs mit schlechten Lungenfunktionsparametern und einer inhalativen Antibiotikatherapie korreliert und diese nach mehreren Passagen in reichhaltigem Flüssigmedium zu einem schnell wachsenden Phänotyp revertieren. Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung der molekularbiologischen Zusammenhänge, die zu diesem phänotypischen Switch bei P. aeruginosa in der CF-Lunge führen und insbesondere den SCV-Phänotyp entstehen lassen. Besondere Aufmerksamkeit wurde dabei einer klinischen Subgruppe von autoaggregativen und hyperpilierten SCVs geschenkt, die scheinbar mit ihrer erhöhten Fähigkeit zur Biofilmbildung in der einzigartigen Umwelt der CF-Lunge selektioniert werden. Mit der Hypothese, dass Mutation und Selektion die treibenden Kräfte der morphologischen Differenzierung sind, wurde eine Transposonmutagenese mit einer SCV und einem Wildtyp eines klinischen P. aeruginosa-Stammes durchgeführt. Einzelne Gene, deren Mutationen zu einem langsam oder schnell wachsenden Phänotyp bei P. aeruginosa führen, sollten auf diesem Wege identifiziert werden. Im Wildtyp eines klinischen P. aeruginosa-Stammes führten 20 unterschiedliche Mutationen zu einem langsam wachsenden Phänotyp und in der zum Wildtyp klonalen SCV führten 11 unterschiedliche Mutationen zu einem schnell wachsenden Phänotyp. Beim Vergleich der Transposonmutanten in ihrer Koloniemorphologie ließ sich insbesondere unter den langsam wachsenden Mutanten eine erhebliche Variabilität feststellen. Allerdings scheint langsames Wachstum und Autoaggregation bei P. aeruginosa miteinander verknüpft zu sein. Die nähere Untersuchung einer langsam wachsenden und autoaggregativen Transposonmutante (25/C1) zeigte eine Hochregulation der P. aeruginosa chaperone/ usher pathway (cup)-Gene. Offensichtlich kodieren die (cup)-Gene für Fimbrienstrukturen auf der Bakterienzelloberfläche und ihre Expression ist möglicherweise für einen autoaggregativen Phänotyp von P. aeruginosa verantwortlich. Die Ergebnisse in dieser Arbeit deuten darauf hin, dass die cup-Genexpression und damit der autoaggregative Phänotyp von P. aeruginosa möglicherweise durch Proteine mit einer GGDEF-Domäne positiv reguliert wird, während eine negative Regulation der cup‑Genexpression in P. aeruginosa durch eine weitere Domäne und zwar durch die EAL‑Domäne im phänotypischen Variant-Regulator PvrR erfolgt. Die Expression der Fimbrienstrukturen auf der Bakterienzelloberfläche bei P. aeruginosa könnte also in antagonistischer Weise durch Regulatorproteine mit einer GGDEF-Domäne und einer EAL-Domäne über die Umsetzung des neuen Signalmoleküls zyklisches di-GMP beeinflusst werden. Das zyklische di-GMP spielt als intrazelluläres Signalmolekül dabei möglicherweise eine Schlüsselrolle beim phänotypischen Switch von P. aeruginosa.

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Wild, Verena: Molekulare Charakterisierung von langsam wachsenden Subpopulationen (small colony variants) von Pseudomonas aeruginosa isoliert aus dem Respirationstrakt von Mukoviszidosepatienten. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

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