Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Florfenicol-dependent modulation of staphylococcal virulence properties

Blickwede, Maren

There is increasing evidence that subinhibitory concentrations of antibiotics interfere with host-pathogen interactions. It has been shown that the expression of several virulence-associated genes of Staphylococcus (S.) aureus may be affected in vitro by low concentrations of various antibiotics, especially those that inhibit protein biosynthesis. The aim of this study was to investigate the influence of subinhibitory concentrations of florfenicol (Ff), a fluorinated chloramphenicol derivative, on growth, morphology and viability [Chapter 2] and on virulence properties [Chapters 3-5] of S. aureus. In the first part of this study [Chapter 2], it was shown that S. aureus strain Newman, when grown in the presence of a high subinhibitory concentration of Ff, exhibited a distinct growth retardation and a significant increase in cell wall thickness. The latter effect might result in a compression of the protoplast with subsequent disruption of single staphylococcal cells. Electron microscopy revealed approximately 20% of the S. aureus Newman cells to be disrupted. However, a bactericidal activity was not recorded at this concentration. Since the ability of S. aureus to adhere to host tissues is essential for the colonization and further establishment of the infection, the second part of this study [Chapters 3-5] focussed on adherence to epithelial cells as the initial step of staphylococcal infections. It was demonstrated that Ff-susceptible and Ff-resistant S. aureus strain Newman exhibited increased adherence to and invasion of HEp-2 cells, when grown in the presence of the strain-specific ½ the minimum inhibitory concentration (MIC) of Ff. Interactions with the adherence-mediating ligands fibronectin and fibrinogen were shown to play an important role in this process. Northern slot blot analysis revealed that the amounts of transcripts of the genes fnbA, fnbB, coa, emp and eap, coding for specific adhesins that can bind fibronectin and/or fibrinogen, were increased in the presence of ½ MIC of Ff. Under the same conditions expression of the type 5 capsular polysaccharide (CP5), that can mask surface proteins involved in adherence, was distinctly decreased. Since it is known that global regulatory systems can modulate the expression of adhesins, their role in the increased adherence was investigated by including three mutants with functionally inactive global regulator systems agr, sar, or sae. A comparison of the S. aureus Newman and its mutants indicated that the Ff-dependent increased adherence to fibronectin- or fibrinogen-coated microtiter plates and to HEp-2 cells is a process in which the sae system, but not the agr or sar system, might be involved. In contrast to components of the agr or sar system, expression of saeRS was increased, suggesting a potential sae-directed decrease in the expression of CP5 and increase in expression of specific adhesins, respectively. Analysis of RNA stability revealed that the increased amount of transcripts coding for the global regulator sae, and also for specific adhesins, in the presence of Ff was, at least partially, due to a stabilization of the respective mRNAs. These results allow to hypothesize that stabilization of transcripts coding for the global regulator sae and a sae-directed decreased expression of CP5, as well as increased expression of specific adhesins, and stabilization of the mRNA coding for these adhesins may contribute synergistically to the Ff-induced adherence of S. aureus. To differentiate a Ff-specific effect from a general stress response, that may be produced by antibiotics that inhibit bacterial protein biosynthesis, it was tested whether a high subinhibitory concentration of clindamycin (Cli) may yield the same results. However in contrast to Ff, no significant change in adherence properties was detectable when S. aureus Newman was treated with ½ MIC of Cli. In conclusion, the results of this study showed that a subinhibitory concentration of Ff may have significant effects on physiology and virulence properties of S. aureus. Consequently, this could substantially influence the management of S. aureus infections.

Es ist bekannt, dass subinhibitorische Konzentrationen von Antibiotika die Erreger-Wirt-Interaktionen beeinträchtigen können. Es hat sich gezeigt, dass die Expression verschiedener Virulenz-assoziierter Gene von Staphylococcus (S.) aureus in vitro durch niedrige Konzentrationen zahlreicher Antibiotika, insbesondere solcher, die die Proteinbiosynthese der Bakterien hemmen, beeinflusst werden kann. Das Ziel der vorliegenden Studie war es, den Einfluss von subinhibitorischen Konzentrationen von Florfenicol (Ff), einem fluorinierten Chloramphenicolderivat, auf Wachstum, Morphologie und Vitalität [Kapitel 2], sowie  Virulenzeigenschaften [Kapitel 3 bis 5] von S. aureus zu untersuchen. In dem ersten Teil der Arbeit [Kapitel 2] wurde gezeigt, dass S. aureus Newman in Anwesenheit einer hohen subinhibitorischen Konzentration von Ff eine deutliche Wachstumsverzögerung und eine Verstärkung der Zellwanddicke aufweist. Diese Zellwandverdickung kann schließlich zu einer Kompression des Protoplasten mit nachfolgender Zerstörung der Staphylokokkenzellen führen. Elektronenmikroskopische Untersuchungen belegten, dass ungefähr 20% der S. aureus Newman Zellen unter diesen Bedingungen geschädigt waren. Eine bakterizide Wirkung von Ff unterhalb der minimalen Hemmkonzentration konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. Da die Fähigkeit von S. aureus zur Adhärenz an Wirtzzellen den initialen Schritt für eine Kolonisierung und damit auch für den weiteren Infektionsverlauf darstellt, beschäftigte sich der zweite Teil dieser Arbeit [Kapitel 3 bis 5] mit der Ff-modulierten Adhärenz von S. aureus an Epithelzellen. Es wurde zunächst gezeigt, dass sowohl Ff-empfindliche wie auch Ff-resistente S. aureus Newman-Zellen eine verstärkte Adhärenz an und Invasion in HEp-2-Zellen aufwiesen, wenn sie in der Anwesenheit von einer stammspezifischen ½ minimalen Hemmkonzentration (MHK) Ff angezüchtet wurden. Es zeigte sich, dass Interaktionen mit den Adhärenz-vermittelnden Liganden Fibronektin und Fibrinogen eine wichtige Rolle in diesem Prozess spielen. Anhand von Northern Slot Blot Analysen wurde festgestellt, dass die Transkipte der Gene fnbA, fnbB, coa, emp and eap, die für spezifische Fibronektin- und/oder Fibrinogen-bindende Adhäsine kodieren, in Anwesenheit von ½ MHK Ff deutlich vermehrt vorhanden waren. Unter den gleichen Bedingungen wurde die Expression des Typ 5 Kapselpolysaccharids (CP5), das Oberflächenproteine, die in der Adhärenz involviert sind, maskieren kann, deutlich verringert. Da es bekannt ist, dass auch globale regulatorische Systeme die Expression der Adhäsingene beeinflussen, wurde die Rolle solcher Regulatoren unter Einbeziehung dreier Mutanten mit funktionell inaktiven globalen Regulatorsystemen agr, sar bzw. sae untersucht. Ein Vergleich von S. aureus Newman und entsprechenden Mutanten zeigte, dass die Adhärenz an Fibronektin- oder Fibrinogen-beschichtete Mikrotiterplatten und an HEp-2-Zellen einen Prozess darstellt, in den das sae-System möglicherweise, jedoch nicht das agr- oder sar-System, involviert ist. Im Gegensatz zu Komponenten des agr- oder sar-System wurde die Expression von saeRS verstärkt, was auf eine potentielle sae-gerichtete Abnahme der Expression von CP5 sowie eine sae-gerichtete Zunahme der Expression spezifischer Adhäsine schließen lässt. Analysen der RNA-Stabilität zeigten, dass die erhöhten Transkriptmengen des globalen Regulators sae sowie der Adhäsingene zumindest teilweise auf einer Stabilisierung der entsprechenden mRNAs beruhten. Aus dem Zusammenspiel der Stabilisierung der Transkripte des globalen Regulators sae, verbunden mit einer sae-gerichteten verringerten Expression von CP5 sowie einer verstärkten Expression spezifischer Adhäsine, und der Stabilisierung der mRNA spezifischer Adhäsingene lässt sich die Ff-induzierte Adhärenz von S. aureus erklären. Um einen Ff-spezifischen Effekt von einer allgemeinen Stressantwort zu unterscheiden, die möglicherweise durch Proteinbiosynthesehemmer hervorgerufen werden könnte, wurde untersucht, ob eine entsprechende subinhibitorische Konzentration von Clindamycin (Cli) die gleichen Ergebnisse hervorrufen kann. Jedoch konnte im Gegensatz zu Ff keine signifikante Veränderung der Adhärenzeigenschaften gemessen werden, wenn S. aureus Newman mit der ½ MHK Cli behandelt wurde. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass subinhibitorische Konzentrationen von Ff deutliche Effekte auf die Physiologie und Virulenzeigenschaften von S. aureus haben können, die folglicherweise wesentlich das Management von S. aureus-Infektionen beeinflussen können.

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Blickwede, Maren: Florfenicol-dependent modulation of staphylococcal virulence properties. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

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