Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Mechanismen der Antikörper-vermittelten Immunität des Respirationstraktes bei Infektionen mit Burkholderia pseudomallei

Klocke, Sonja

The gram-negative and facultative intracellular bacterium Burkholderia pseudomallei is the causative agent of Melioidosis. The host spectrum reaches from men to various animals. The disease occurs in different clinical manifestations, whereas the most common local form is a pneumonia. The mechanisms of host defence against this pathogen are mainly unknown so far. Especially the mechanisms and protective importance of IgG compared to IgA in mucosal protection of the respiratory tract in bacterial infection are rarely examined. Aim of this project was to determine and compare the protective value and used mechanisms in host protection of IgG and IgA with specificity for Exopolysaccharide (EPS) on the example of a Burkholderia pseudomallei infection. Therefore a murine Burkholderia pseudomallei pneumonia model with mouse strains of different susceptibility was used. The role of antibody mediated mucosal immunity after passive immunisation oft the respiratory tract with anti-EPS IgG- and IgA-isotype switch-variants was examined in vivo. In order to clarify the importance of Fc-receptors in this model the experiments were also performed with Fcγ-chain deficient mice. In this study was demonstrated that passive protection in the murine respiratory tract by EPS specific IgG induced a reduced and delayed mortality after infection with Burkholderia pseudomallei, which was also correlated with a lower bacterial burden in the lung. This IgG mediated protection was dependent on the Fcγ-receptors I and III. In contrast the corresponding IgA isotype showed no protective effect in this model. Burkholderia pseudomallei is a facultative intracellular pathogen and able to survive and multiply intracellularly e.g. in macrophages. The classical substances of intracellular killing in macrophages are nitric oxide (NO) and reactive oxygen intermediates (ROI). For further characterisation of hostspecific protection the production of NO and ROI, especially in connection with antibody mediated effects have been examined. On the one hand it turned out that bone marrow derived macrophages of the resistant C57Bl/6 strain produced significantly higher amounts of NO and ROI compared to macrophages of the highly susceptible BALB/c mice. On the other hand only EPS-immune-complexes of IgG isotypes were able to induce nitric oxide production in bone marrow derived macrophages while IgA immune-complexes were not. This stimulation was mediated in the case of IgG2a-complexes by the Fcγ-receptors I and III only IgG2b-complexes stimulated NO also via Fcγ-receptor IIB. In all cases the global transcription factor NF-κB was essential for EPS-immune-complex mediated stimulation of NO. From these observations one can conclude that Fcγ-mediated NO-production is a major factor in the defence of Burkholderia pseudomallei infection on the level of macrophages, and may serve as an explanation for the different susceptibilities of both mouse strains as well as for the missing protection via IgA in vivo. Surprisingly investigations on iNOS knock-out mice revealed no difference in susceptibility and protection by passive immunisation with IgG after Burkholderia pseudomallei infection compared to C57Bl/6 mice in vivo. Also the intracellular bactericidal function of primary iNOS knock-out macrophages was not impaired by the absence of NO. In contrast to that p47phox knock-out mice showed a higher susceptibility compared to C57Bl/6 mice in vivo after Burkholderia pseudomallei infection. Nevertheless the intracellular bactericidal function of macrophages from p47phox knock-out and C57Bl/5 wildtyp mice showed no difference in vitro. This lead to the impression that ROI plays a major role in host defence against Burkholderia pseudomallei in vivo which goes beyond the pure function of intracellular killing, whereas C57Bl/6 mice seem to possess a redundant system of different mechanisms of intracellular killing on the level of macrophages.

Burkholderia pseudomallei ist ein gram-negatives fakultativ intrazelluläres Bakterium, welches ätiologisch für den Krankheitskomplex der Melioidose verantwortlich ist. Das Wirtsspektrum umfasst den Menschen, aber auch zahlreiche Tierarten. Die Erkrankung tritt in verschiedenen klinischen Verlaufsformen auf, wobei die häufigste lokalisierte Form eine Pneumonie ist. Die Mechanismen der Wirtsabwehr gegen diesen Erreger sind bislang weitgehend unbekannt. Insbesondere die Mechanismen und die Bedeutung von IgG im Vergleich zu IgA für die mukosale Protektion des Respirationstraktes bei Infektionen mit Burkholderia pseudomallei sind bislang wenig untersucht. Ziel dieses Projektes war es, am Beispiel der Infektion mit Burkholderia pseudomallei die Rolle von IgA und IgG mit Spezifität für Exopolysaccharid (EPS) dieses Erregers hinsichtlich ihrer protektiven Bedeutung und der verwendeten Mechanismen vergleichend zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde in einem murinen Burkholderia pseudomallei-Pneumoniemodell mit unterschiedlich empfänglichen Mausstämmen in vivo die Bedeutung der Antikörper-vermittelten mukosalen Abwehr durch passive Immunisierung des Respirationstraktes mit Anti-EPS IgG- und IgA-Isotyp-Switch-Varianten untersucht. Um die Bedeutung der Fc-Rezeptoren in diesem Modell aufzuklären, wurden in diesen Experimenten auch Fcγ-Ketten-defiziente Mäuse eingesetzt. Hier konnte gezeigt werden, dass eine passive Protektion im murinen Respirationstrakt durch EPS-spezifisches IgG zu einer verringerten und verzögerten Mortalität bei Infektionen mit Burkholderia pseudomallei führt, die auch mit einer geringeren Keimzahl in der Lunge korreliert. Die IgG-vermittelte Protektion war dabei an das Vorhandensein der Fcγ-Rezeptoren I und III gekoppelt. Im Gegensatz dazu zeigte die entsprechende polymere IgA (pIgA) -Isotyp-Switch-Variante keine protektiven Effekte in diesem Modell. Da Burkholderia pseudomallei als fakultativ intrazelluläres Pathogen in der Lage ist, z.B. in Makrophagen zu überleben und sich sogar zu vermehren, wurden zur weiteren Charakterisierung wirtsspezifischer Protektion die klassischen Mechanismen der intrazellulären bakteriziden Aktivität von Makrophagen, Stickoxid (NO) -Produktion und Freisetzung reaktiver Sauerstoffe (ROI), vor allem in Verbindung mit Antikörper-vermittelten Effekten untersucht. Zum einen zeigte sich, dass die Knochenmarkmakrophagen des resistenten Mausstamms C57Bl/6 wesentlich höhere Mengen NO und ROI freisetzen, als die Makrophagen aus dem hochempfänglichen BALB/c-Stamm. Des Weiteren waren lediglich IgG- jedoch nicht pIgA-EPS-Immunkomplexe in der Lage, die NO-Produktion von Knochenmarkmakrophagen zu stimulieren. Dabei erfolgte die Stimulation durch IgG2a-Immunkomplexe ausschließlich über die Fcγ-Rezeptoren I und III und durch IgG2b-Immunkomplexe auch über den Fcγ-Rezeptor IIB, wobei in jedem Fall die Aktivierung des globalen Transskriptionsfaktors NF-κB essenziell für die NO-Produktion war. Diese Beobachtungen ließen vermuten, dass die Fc-vermittelte NO-Produktion der entscheidende Faktor bei der Bekämpfung einer Burkholderia pseudomallei Infektion auf Makrophagenebene ist und lieferten scheinbar sowohl eine Erklärung für die unterschiedlichen Resistenzen beider Mausstämme, als auch für die fehlende Protektion durch IgA in vivo. Untersuchungen an iNOS-Knock-out Mäusen zeigten jedoch bei Infektionen mit Burkholderia pseudomallei im Vergleich zu C57Bl/6-Mäusen weder eine höhere Suszeptibilität dieser Tiere noch eine Beeinträchtigung der IgG-vermittelten Protektion nach passiver Immunisierung in vivo. Auch die intrazelluläre Bakterizidie primärer iNOS Knock-out-Makrophagen war durch das Fehlen von NO in vitro nicht beeinträchtigt. Im Gegensatz zu iNOS zeigten p47phox-Knock-out Mäuse in vivo eine deutlich höhere Suszeptibilität gegenüber Burkholderia pseudomallei als C57Bl/6-Mäuse. Beim Vergleich der intrazellulären bakteriziden Funktionen der Makrophagen in vitro war allerdings kein Unterschied zu beobachten. Dies lässt darauf schließen, dass reaktive Sauerstoffe in vivo eine entscheidende Rolle für die Bekämpfung von Burkholderia pseudomallei-Infektionen spielen, die über die reine Funktion der intrazellulären Bakterizidie hinausgeht, wobei C57Bl/6-Mäuse auf Makrophagenebene offenbar über ein redundantes System verschiedener Mechanismen zur bakteriellen Abwehr verfügen.

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Klocke, Sonja: Mechanismen der Antikörper-vermittelten Immunität des Respirationstraktes bei Infektionen mit Burkholderia pseudomallei. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

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