Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zur Typ I Allergie des Pferdes

Rohwer, Jens

Growing incidence of immediate hypersensitivities (type I allergies) in man and beast directed  an increased attention to the relevant mechanisms, leading to a clinical manifestation of type I hypersensitivities in vivo. In humans the specific immunotherapy (SIT) is the only causative therapy at time, without knowing the contributing mechansims or mediators in detail. In the fields of veterinary medicine the requirements for available therapies become particulary relevant in regard to sweet itch or summer eczema, an atopic dermatitis in horses.   The functional in vitro test (FIT, developed in our institute) that determines the reacticity of equine basophil granulocytes quantifying the amount of released histamine after stimulation of the cells, permits a discrimination of allergic and non-allergic horses. We assess the specificity (allergen induced release), the amount (dose-response of the stimuli) as well as the isotype of the sensitizing antibodies (release via anti isotype antibodies), that have bound to Fc-receptors on basophils. The aim of this study was to characterise the relevant sensitizing antibodies and their ability to modulate a histamine release from equine basophils.           Following questions were processed in this thesis:   1.               How reproducible is the FIT as a tool to determine the allergic state of horses? Having 37 icelandic horses at disposal, cherished under identical conditions, we were enabled to repeatingly assess their general sensitization (antibody isotypes bound to basophils) as well as their specific sensitization (allergen induced). It could be shown, that assessing the general sensitization of one indidvidual there is only limited fluctuation, whereas the allergen-induced release more drastically differs throughout the seasons. 2.               Which cells from peripheral blood leucocytes (PBL) express receptors for IgE? After incubating equine PBL with a monoclonal antibody anti equine IgE (mAB anti eqIgE ) the marked cells were determined in a flow cytometer. Furthermore, the marked cells were sorted using magnetic beads coupled to the mAB anti eqIgE. Afterwards theses cells were stainded and investigated using light microscopy. IgE was found on basophils and monocytic cells and, to a lower amount on lymphocytes. In the ex vivo pool of PBL monocytes were found to be relatively and absolutely the largest population positive for IgE. After enriching IgE-bearing cells in the magnetic field, basophils and monocytes were equally distributed, each type counting for almost 50% of the enriched cells, whereas all other leucocytes were only present in traces. 3.               Which immunoglobulin isotypes sensitize equine basophils?            The assessment of the general sensitization includes an IgE and IgG mediated release. A possible crossreactivity of these stimuli was excluded by means of an indirect ELISA-system. The evaluation of more than 300 horses in the FIT resulted in a majority of horses that reacted upon both stimuli (88,3%). Reacting only to IgE there were 8,5%, only to IgG 5,2% were found. As the FIT is carried out in the presence of all other cells found in PBL, it is not clarified, if other cells than basophils influence the release of histamine. 4.               Does the sensitization due to more than one isotype differ in quality?            Concerning the repeatability of the two modes to assess the general sensitization it could be shown, that the values might differ in time course, but stay quite constant in their ratio for one individual horse. Thereby we could separate horses into low and high responders upon stimulation with IgE. For all tested horses the IgG mediated release was always higher than the IgE mediated release. 5.               Is there a biological impact for a sensitization with more than one isotype?          For 37 horses the reaction to the anti isotype antibodies was observed every 2-3 weeks in the FIT for a whole summer period. For each horse the ratio between those two stimuli was generated (IgE to IgG) and the individual quotients were compared. Interestingly, this ratio ranked from 0,17 (low IgE, high IgG) to 0,88. Healthy horses showed significantly lower ratios than allergic horses. Individuals that altered their clinical signs of allergy showed also an alteration in their ratio of IgE to IgG mediated release. 6.               Do basophils from allergic horses react stronger to an IgE mediated release than non allergic horses?       In order to gain a discrimination of allergic horses from healthy ones only by one anti isotype release, the absolute amounts of released histamine due to the two modes of the general sensitization were solely correlated to clinical signs of atopic dermatitis. No significantly higher IgE mediated release could be found for diseased horses. 7.               Which IgG isotype is responsible for the anti IgG driven release?   The sensitization of equine basophils via IgG is performed using a polyclonal antiserum against equine IgG. Right now we are at hand of 4 monoclonal antibodies anti equine isotypes out of the seven proposed IgG isotypes of the horse, that are anti IgG1, G2, G4 & G5. None of these alone or in combination were able to provoke a histamine release from equine basophils. 8.               Is it possible to modulate the release of histamine by coincubating anti IgE or allergen with anti IgG isotype AB´s?  A coincubation of those distinct mAB anti eqIgG isotypes with mAB anti eqIgE or allergen revealed an inhibition of the histamine release for all tested horses and all mAB anti eqIgG isotypes up to 50%, respectively. Irrelevant mAB´s of the same isotype used as controls showed no reduction in the release of histamine. As there are no data available regarding the Fcg receptors, especially inhibitory receptors, the relevant isotypes or receptors could not be pointed out. Summing up, it was shown that equine allergic effector cells are sensitized by more than one isotype. Evidence is given for a shifted function concerning this dual sensitization in allergic horses. Furthermore, IgG isotypes are capable of blocking the release of histamine, as we know from the human system. Though it remains unclear for man and horse which isotypes or mechanisms take response for the shown IgG mediated blocking.

Auf Grund der zunehmenden Inzidenz allergischer Erkrankungen bei Mensch und Tier wird den verantwortlichen Mechanismen, die in vivo zur Ausprägung einer Typ I Allergie führen, vermehrt Beachtung geschenkt. Im humanen System stellt die spezifische Immuntherapie (SIT) die zur Zeit einzige kausale Therapieform dar, ohne dass die beteiligten Mechanismen oder Mediatoren im Detail geklärt sind.        Der in der Arbeitsgruppe Immunologie entwickelte funktionale in vitro Test (FIT) zur Erfassung der Reagibilität basophiler Granulozyten mittels der Bestimmung freigesetzten Histamins nach Stimulation erlaubt es, sensibilisierte Individuen von nicht allergischen Pferden zu diskriminieren. Dabei wird die Spezifität (Freisetzung über Allergen), die Menge (Dosis-Antwort des Stimulus) sowie der Isotyp der sensibilisierenden Antikörper (Freisetzung über anti Isotyp-Antikörper), die an Fc-Rezeptoren von Basophilen gebunden haben, bestimmt.          Ziel dieser Arbeit war es, die relevanten sensibilisierenden Isotypen sowie die Modulation der Histaminfreisetzung durch diese zu charakterisieren. Ferner sollten die Effektorzellen einer Typ I Allergie im equinen System genauer charakterisiert werden.         Folgende Fragestellungen wurden im Rahmen dieser Untersuchungen bearbeitet:   1.          Wie reproduzierbar ist der funktionelle in vitro Test zur Bestimmung des Typ I         Allergiestatus beim Pferd?     Die zur Verfügung gestellte Herde aus 26 Islandpferden ermöglichte es, im Rahmen dieser Arbeit wiederholte Bestimmungen der generellen (Erfassung des Besatzes mit Antikörpern) sowie spezifischen Sensibilisierung (Allergen vermittelt) im FIT unter identischen Haltungsbedingungen vorzunehmen. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Erfassung der generellen Sensibilisierung auf Einzeltierebene nur geringen Schwankungen unterliegt, während die Allergen-induzierte Freisetzung im Jahresverlauf deutlich schwankte. 2.          Welche Zellen im peripheren Blut des Pferdes exprimieren Rezeptoren für IgE?           Nach einer Inkubation equiner PBL mit einem monoklonalen Antikörper gegen equines IgE (mAK anti eqIgE ) wurden die so markierten Zellen einerseits durchflusszytometrisch erfasst, andererseits durch magnetische Kügelchen, an die ein Ratte anti Maus IgG (H+L) Antikörper gekoppelt war, nur solche Zellen angereichert, die zuvor den mAK anti eqIgE gebunden hatten. Anschließend wurden diese Zellen lichtmikroskopisch charakterisiert. Dabei konnte IgE auf Basophilen und monozytoiden Zellen, sowie in geringerem Maße auf lymphoiden Zellen nachgewiesen werden. Im nativen Pool der PBL stellten die monozytoiden Zellen relativ wie absolut den höchsten Anteil IgE+ Zellen. Nach der Anreicherung im magnetischen Feld fanden sich Basophile und monozytoide Zellen in vergleichbarer Verteilung (jeweils knapp 50%), wobei die an hundert fehlenden Zellen sich aus Neutrophilen, Eosinophilen sowie Lymphozyten zusammensetzten (weniger als 10% aller Zellen). 3.          Welche Immunglobulin-Isotypen sensibilisieren equine Basophile?    Die Überprüfung der generellen Sensibilisierung umfasst einen IgE vermittelten Release, sowie einen IgG vermittelten Release. Zwischen diesen beiden Stimuli konnte mi einem ELISA-System eine Kreuzreaktivität ausgeschlossen werden. Bei der Auswertung von über 300 Pferden konnte gezeigt werden, dass die meisten Pferde auf beide Stimuli reagierten (88,3%). Nur auf IgE zeigten 8,5% eine Reaktion, nur IgG vermittelt reagierten 5,2%. Da die Histaminfreisetzung im Pool der Leukozyten stattfindet, ist hiermit nicht ausgeschlossen, dass andere Zellen als Basophile die Histaminfreisetzung beeinflussen. 4.          Unterscheidet sich die Sensibilisierung über mehr als einen Isotyp qualitativ?       Bei wiederholter Bestimmung Histaminfreisetzungen über anti Isotyp Antikörper (anti IgE sowie anti IgG) konnte gezeigt werden, dass die Höhe der einzelnen Freisetzungen im zeitlichen Verlauf schwankt. Die interindividuellen Schwankungen waren hingegen stärker als die intraindividuellen. So konnten Pferde als high oder low responder bezüglich der anti IgE Freisetzung eingestuft werden. Die IgG vermittelte Freisetzung war bei den hier untersuchten Tieren immer höher als die IgE vermittelte.  5.          Welche Bedeutung hat die Sensibilisierung durch mehr als einen Isotypen?         Bei 37 Pferden wurden die Reaktionen auf die anti Isotyp Antikörper für ein Sommerhalbjahr in 2-3 wöchentlichem Abstand im FIT erfasst. Zusätzlich wurden diese zwei Freisetzungen zu einander ins Verhältnis gesetzt (anti IgE zu anti IgG bedingte Histaminfreisetzung) und die Tiere miteinander verglichen. Das Verhältnis innerhalb dieser Population schwankte zwischen 0,17 (anti IgE niedrig, anti IgG hoch) und 0,88. Die gesunden Individuen der Herde hatten einen signifikant niedrigeren Verhältniswert als die Gruppe der Allergiker. Individuen, die innerhalb des untersuchten Zeitraums ihren klinischen Status änderten, zeigten auch einen dementsprechend veränderten Verhältniswert von anti IgE zu anti IgG.        6.          Reagieren Basophile von allergischen Pferden stärker auf einen IgE vermittelten Release   als die gesunder?        Um die Diskriminierung allergischer Pferde von gesunden mittels des Verhältnisses der anti Isotyp Antikörper auf einen Isotyp zu begrenzen, wurden die absoluten Histaminfreisetzungen für die zwei Stimuli der generellen Sensibilisierung mit dem klinischen Bild der atopischen Dermatitis ins Verhältnis gesetzt. Dabei konnte keine signifikant höhere Freisetzung durch IgE in der Gruppe klinisch erkrankter Pferde gezeigt werden. 7.          Welcher IgG Isotyp ist für die Freisetzung von Histamin durch den IgG vermittelten     Release verantwortlich?         Die Sensibilisierung der Basophilen mit IgG Antikörpern wird über ein polyklonales Serum gegen eqIgG erfasst. Zur Zeit stehen gegen 4 der 7 IgG Isotypen des Pferdes mAK zur Verfügung (anti IgG1, G2, G4 & G5). Durch keinen dieser mAK gelang es, eine Histaminfreisetzung aus Basophilen zu provozieren. 8.          Kann die Histaminfreisetzung durch Koinkubation von anti IgE oder Allergen mit anti  IgG Isotypen moduliert werden?   Eine Koinkubation der einzelnen mAK anti eqIgG mit mAK anti eqIgE oder Allergen zeigte bei allen untersuchten Pferden für alle eingesetzten mAK eine Inhibition der Histaminfreisetzung um bis zu 50%. Da bisher keine Daten über die Fc-Rezeptoren des Pferdes vorliegen, konnte der relevante Rezeptor für diese Inhibition nicht bestimmt werden. Irrelevante mAK Isotypen, die als Kontrolle eingesetzt wurden, konnten keine Inhibition hervorrufen. Zusammenfassend konnte aufgezeigt werden, dass equine allergische Effektorzellen über mehr als einen Isotyp sensibilisiert werden. Hinweislich kann eine veränderte Reaktionsbereitschaft bezüglich der Sensibilisierung Basophiler durch IgE und IgG von allergischen Pferden gefunden werden. Weiterhin können IgG Isotypen wie im humanen System die Histaminfreisetzung blockieren. Allerdings fehlen beim Pferd wie beim Mensch die Erkenntnisse über die relevanten modulierenden IgG Isotypen sowie den Mechanismus einer IgG bedingten Hemmung

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Rohwer, Jens: Untersuchungen zur Typ I Allergie des Pferdes. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.

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