Differentielle Gentranskription bei Hypobiose induzierten und nicht induzierten dritten Larven von Dictyocaulus viviparus

Die Diktyokaulose ist eine der bedeutsamsten parasitären Erkrankungen der Weiderinder. Dabei sind unerkannt mit hypobiotischen Lungenwurmstadien infizierte Tiere bezüglich der Verbreitung der Parasitenpopulation von Jahr zu Jahr von besonderer epidemiologischer Be­deutung. Davon ausgehend, dass die Entwicklungshemmung nach der Induktion durch Außenfaktoren einer genetischen Regulation unterliegt, wurde die Gentranskription von Hypo­biose induzierten und nicht induzierten dritten D. viviparus-Larven vergleichend unter­sucht. Zur Untersuchung der differentiellen Gentranskription bei Hypobiose induzierten und nicht induzierten Drittlarven erfolgte unter Anwendung der Suppression Sub­tractive Hybridization eine Anreicherung der differentiellen Transkripte zur Erstellung sub­trahierter cDNA-Banken. Diese enthielten 105 Klone der Hypobiose induzierten und 104 Klone der nicht induzierten Lungenwurmlarven. Nach der Überprüfung der cDNA-Banken mit der Technik des Differential Screenings verblieben 58 Klone der Hypobiose induzierten und 44 Klone der nicht induzierten Stadien, von denen 26 respektive 22 Klone mittels Southern dot blotting verifiziert werden konnten. Von den insgesamt 48 Genfragmenten zeigten 20 Transkripte signifikante Homologien mit 16 verschiedenen Nuklein- bzw. Proteinsequenzen. Unter Anwendung der Rapid Amplification of cDNA Ends und einer spliced leader 1 (SL1)-spezifischen PCR wurden 16 der differentiellen Gensequenzen sowohl in 3´- als auch in 5´-Richtung komplettiert. Im Zuge dieser Vervollständigung ergaben sich für neun verschiedene Gensequenzen Transkriptvarianten. Ein erneuter Sequenzidentitätsvergleich erbrachte bezüglich der nicht induzierten Larven aussagekräftige Übereinstimmungen mit extrazellulären Kupfer-Zink-Su­peroxiddismutasen (SOD), Paramyosinen, nukleären anchorage Proteinen, dem Vorläufer eines ex­kretierten/sezernierten Proteins, einem putativen Protein bilateralen Ursprungs und einem weiteren putativen Protein. Diese Identitäten bezogen sich auf Sequenzen von C. elegans, mitunter auch auf parasitische Nematoden und andere Invertebraten als auch auf Verte­braten. Bei den Hypobiose induzierten Dictyocaulus-Larven konnten signifikante Homolo­gien mit Phenylethanolamin-N-Methyltransferasen (PNMT), Guanylyl-Cyclasen, Calmoduli­nen, Glycerin-Ki­nasen, DM-DNA-Bindungsdomänen enthaltenden Proteinen und einer Kal­zium-unabhängi­gen Phospholipase A2 der oben angeführten Organismen festgestellt werden. Diese Proteine, welche funktional an der Signalregistrierung und -transduktion, der Zelltei­lung und -differen­zierung, der Regulation der Transkription, dem Metabolismus und der Lo­komotion beteiligt oder in Parasit-Wirt-Interaktionen involviert sind, können in fast allen Fällen mit der inhibierten respektive nicht inhibierten Entwicklung in Zusammenhang ge­bracht werden. Mit dem PNMT- und dem SOD-Homolog wurde zur Bestimmung der Trans­kriptionsrate in den Hypobiose induzierten und nicht induzierten Larven eine quantitative real-time PCR vorgenommen. Bei dem PNMT-Homolog er­gaben sich signifikante Unter­schiede der in den beiden Larvenpopulationen vorliegenden Kopienzahlen, wodurch die differentielle Transkription auch mit dieser Methode bestätigt werden konnte. Um der Frage nachzugehen, ob bei D. viviparus Genhomologe der so genannten dauer formation (daf)-Gene und des age-1 Gens, welche bei dem frei lebenden Erdnematoden C. elegans die larvale Entwicklung regulieren, vorhanden sind, wurden von zwölf dieser Gene insgesamt 35 spezifische Primerpaare ausgewählt. Die Klonierung und Sequenzierung von 83 Amplifikationsprodukten ergab jedoch keinen Hinweis auf das Vorhandensein solcher Gene bei D. viviparus, für dessen mRNA jedoch die Existenz der SL1-Sequenz nachgewiesen werden konnte.   Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit geben erste Einblicke in die genetischen Steuerungsmechanismen der inhibierten und nicht inhibierten Larvenentwicklung des bovinen Lungenwurms.