Differentielle Gentranskription bei Hypobiose induzierten und nicht induzierten dritten Larven von Dictyocaulus viviparus
Dictyocaulosis is one of the most important parasitic diseases in first-year grazing calves. Cattle infected with hypobiotic larvae play an important epidemiological part as silent carriers, ensuring parasite survival from year to year. Assuming that inhibition of development of D. viviparus induced by external factors is genetically regulated, the gene transcription of hypobiosis induced and not induced third-stage larvae was compared. To investigate differential gene transcription of hypobiosis induced and not induced larvae Suppression Subtractive Hybridization was used to enrich differentially transcribed gene fragments for creating subtracted libraries, containing 105 clones of the inhibited and 104 clones of the not inhibited larvae. After Differential Screening, 54 clones of the hypobiosis induced and 44 clones of the not induced stages were remaining as differential sequences. From these, 26 and 22 clones could be verified by Southern dot blotting, respectively. Of the in all 48 gene transcripts 20 transcripts showed significant homologies with 16 different nucleotide and protein sequences, respectively. By performing Rapid Amplification of cDNA Ends and a spliced leader 1 (SL1) specific PCR, the full length of 16 sequences for the 3´- as well as the 5´-end was obtained, thereby observing transcript variants of nine gene sequences. Renewed search for sequence identities to the transcripts of the not induced larvae resulted in significant homologies to extracellular cooper/zinc superoxide dismutases (SOD), paramyosins, nuclear anchorage proteins, a secreted/excreted protein precursor, a putative protein of bilateral origin and another putative protein. These identities were found to sequences of C. elegans, now and then also of parasitic nematodes, other invertebrates as well as of vertebrates. In the hypobiosis induced larvae, there were significant similarities to phenylethanolamine-N-methyltransferases (PNMT), guanylyl cyclases, calmodulins, glycerol kinases, DM DNA binding containing proteins and a calcium-independent phospholipase A2 of the organisms listed above. These proteins are functionally involved in signal registration and transduction, cell division and differentiation, the regulation of transcription, metabolism and locomotion or take part in parasite-host-interactions. In almost all cases these proteins could be connected with arrested and not arrested development, respectively. To investigate the transcription levels of the SOD homologue and the PNMT homologue in the hypobiosis induced and not induced Dictyocaulus-larvae, quantitative real-time PCR was performed. For the PNMT homologue, this method showed significant differences with reference to the copy numbers in the two larval populations, confirming differential gene transcription. To investigate, if there are homologues of the so called dauer formation (daf) genes and the age-1 gene of the free living soil nematode C. elegans existing in D. viviparus, in all 35 primer pairs of 12 of these genes were designed. By cloning and sequencing of 83 amplification products there was no indication of such genes in D. viviparus. By the results of this project there is a first insight to the genetic regulation of inhibited and not inhibited larval development of the bovine lungworm.
Die Diktyokaulose ist eine der bedeutsamsten parasitären Erkrankungen der Weiderinder. Dabei sind unerkannt mit hypobiotischen Lungenwurmstadien infizierte Tiere bezüglich der Verbreitung der Parasitenpopulation von Jahr zu Jahr von besonderer epidemiologischer Bedeutung. Davon ausgehend, dass die Entwicklungshemmung nach der Induktion durch Außenfaktoren einer genetischen Regulation unterliegt, wurde die Gentranskription von Hypobiose induzierten und nicht induzierten dritten D. viviparus-Larven vergleichend untersucht. Zur Untersuchung der differentiellen Gentranskription bei Hypobiose induzierten und nicht induzierten Drittlarven erfolgte unter Anwendung der Suppression Subtractive Hybridization eine Anreicherung der differentiellen Transkripte zur Erstellung subtrahierter cDNA-Banken. Diese enthielten 105 Klone der Hypobiose induzierten und 104 Klone der nicht induzierten Lungenwurmlarven. Nach der Überprüfung der cDNA-Banken mit der Technik des Differential Screenings verblieben 58 Klone der Hypobiose induzierten und 44 Klone der nicht induzierten Stadien, von denen 26 respektive 22 Klone mittels Southern dot blotting verifiziert werden konnten. Von den insgesamt 48 Genfragmenten zeigten 20 Transkripte signifikante Homologien mit 16 verschiedenen Nuklein- bzw. Proteinsequenzen. Unter Anwendung der Rapid Amplification of cDNA Ends und einer spliced leader 1 (SL1)-spezifischen PCR wurden 16 der differentiellen Gensequenzen sowohl in 3´- als auch in 5´-Richtung komplettiert. Im Zuge dieser Vervollständigung ergaben sich für neun verschiedene Gensequenzen Transkriptvarianten. Ein erneuter Sequenzidentitätsvergleich erbrachte bezüglich der nicht induzierten Larven aussagekräftige Übereinstimmungen mit extrazellulären Kupfer-Zink-Superoxiddismutasen (SOD), Paramyosinen, nukleären anchorage Proteinen, dem Vorläufer eines exkretierten/sezernierten Proteins, einem putativen Protein bilateralen Ursprungs und einem weiteren putativen Protein. Diese Identitäten bezogen sich auf Sequenzen von C. elegans, mitunter auch auf parasitische Nematoden und andere Invertebraten als auch auf Vertebraten. Bei den Hypobiose induzierten Dictyocaulus-Larven konnten signifikante Homologien mit Phenylethanolamin-N-Methyltransferasen (PNMT), Guanylyl-Cyclasen, Calmodulinen, Glycerin-Kinasen, DM-DNA-Bindungsdomänen enthaltenden Proteinen und einer Kalzium-unabhängigen Phospholipase A2 der oben angeführten Organismen festgestellt werden. Diese Proteine, welche funktional an der Signalregistrierung und -transduktion, der Zellteilung und -differenzierung, der Regulation der Transkription, dem Metabolismus und der Lokomotion beteiligt oder in Parasit-Wirt-Interaktionen involviert sind, können in fast allen Fällen mit der inhibierten respektive nicht inhibierten Entwicklung in Zusammenhang gebracht werden. Mit dem PNMT- und dem SOD-Homolog wurde zur Bestimmung der Transkriptionsrate in den Hypobiose induzierten und nicht induzierten Larven eine quantitative real-time PCR vorgenommen. Bei dem PNMT-Homolog ergaben sich signifikante Unterschiede der in den beiden Larvenpopulationen vorliegenden Kopienzahlen, wodurch die differentielle Transkription auch mit dieser Methode bestätigt werden konnte. Um der Frage nachzugehen, ob bei D. viviparus Genhomologe der so genannten dauer formation (daf)-Gene und des age-1 Gens, welche bei dem frei lebenden Erdnematoden C. elegans die larvale Entwicklung regulieren, vorhanden sind, wurden von zwölf dieser Gene insgesamt 35 spezifische Primerpaare ausgewählt. Die Klonierung und Sequenzierung von 83 Amplifikationsprodukten ergab jedoch keinen Hinweis auf das Vorhandensein solcher Gene bei D. viviparus, für dessen mRNA jedoch die Existenz der SL1-Sequenz nachgewiesen werden konnte. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit geben erste Einblicke in die genetischen Steuerungsmechanismen der inhibierten und nicht inhibierten Larvenentwicklung des bovinen Lungenwurms.
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Strube, Christina: Differentielle Gentranskription bei Hypobiose induzierten und nicht induzierten dritten Larven von Dictyocaulus viviparus. Hannover 2004. Tierärztliche Hochschule.
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