Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Characterization of gene expression and methylation patterns of the bovine IGF2 gene in gametes and preimplantation embryos of different origins

Gebert, Claudia Maria

DNA methylation at cytosine molecules is one of the best-known mechanisms involved in genomic imprinting. Imprinting plays a crucial role during mammalian embryonic development. Insight into the epigenetic phenomenon of imprinting is mainly derived from mice and humans, and information in bovine imprinting is scarce. The main goal of this study was to analyze the methylation status of the bovine Insulin-like growth factor2 gene (IGF2) in gametes and preimplantation embryos. In addition, expression patterns of the bovine IGF2, Insulin-like growth factor2 receptor (IGF2R) and Mammalian achaete-scute homologue2 (MASH2) genes were characterized in bovine blastocysts. At first, the expression patterns of day 7 bovine blastocysts and expanded blastocysts were analyzed by semi-quantitative RT-PCR. Embryos were produced by in vitro fertilization (IVF) or parthenogenesis (PA). In vitro culture was performed in the semi-defined medium SOF/BSA (Synthetic Oviduct Fluid/Bovine Serum Albumin). This approach allows the indirect determination of a putative mono- or bi-allelic gene expression by measuring the relative amounts of transcriptional products. Paternally expressed genes would be expected to show increased relative amounts of mRNAs in in vitro produced embryos (maternal and paternal genome) compared to their parthenogenetic counterparts. In contrast, maternal mRNA expression would be reflected by an increased relative amount of transcriptional products in parthenogenetic (two maternal genomes) compared to IVF embryos. Hatched in vitro produced blastocysts, in vivo collected blastocysts, ICM (inner cell mass) and trophectoderm cells isolated from in vitro fertilized and parthenogenetic blastocysts were included in the analyses. Cell numbers were determined by differential staining for ICM and trophectoderm cells (in vitro fertilized and parthenogenetic blastocysts). The size of the blastocysts was also measured. Analyses of the methylation level within the bovine IGF2 gene in gametes and preimplantation embryos required sequencing of the gene due to the scarcity of genomic sequence information in farm animals. Only the mRNA sequence of the bovine IGF2 gene was available in the GenBank database when this study was initiated. Two fragments within the untranslated region were identified by PCR amplification of bovine tissue DNA using ovine primer pairs. Intron sequences of the translated region were detected by the same approach but with bovine primers. The newly sequenced fragments of the untranslated region and exon 10 were analyzed for their methylation status in isolated DNA from bovine in vitro matured oocytes and frozen/thawed sperm cells. Methylation levels were determined at 27 CG dinucleotides within exon 10 in bovine preimplantation embryos derived from different origins by bisulfite sequencing. Adult fibroblasts, which were used to generate nuclear transfer embryos, were included in the analyses. Bisulfite sequencing is a highly sensitive method to detect methylated and non-methylated cytosine molecules and is based on the ability of bisulfite to convert non-methylated cytosines into thymine whereas methylated cytosines remain unchanged. The following results were obtained: 1)                 Differential staining revealed similar cell numbers for in vitro fertilized and parthenogenetic blastocysts (<180 µm) and expanded blastocysts (>180 µm). Increased cell numbers (p≤0.05) in expanded in vitro fertilized blastocysts were attributed to a higher number of trophectoderm cells. 2)                 Expanded day 7 in vitro fertilized and parthenogenetic blastocysts expressed the bovine IGF2 and IGF2R genes at similar relative amounts. In contrast, higher relative amounts of transcriptional products of the MASH2 gene were determined for in vitro fertilized blastocysts compared to their parthenogenetic counterparts (p≤0.05). 3)                 Semi-quantitative gene expression analyses extended to in vitro and in vivo produced blastocysts and isolated ICM and trophectoderm cells revealed increased IGF2 expression in expanded in vitro fertilized blastocysts (p≤0.05). In contrast, the IGF2R gene showed higher relative amounts of transcriptional products in ICM cells isolated from expanded in vitro fertilized blastocysts and in hatched parthenogenetic blastocysts (p≤0.05). Similar expression levels were determined in hatched in vitro fertilized and parthenogenetic blastocysts. 4)                 Two fragments isolated within the untranslated region of the bovine IGF2 gene showed high homology (>90%) to exons and introns 4 and 5 of the ovine IGF2 gene. 5)                 CpG islands were detected within the sequences of intron 4 and 5 of the bovine IGF2 gene. In addition, intron 5 contained a promoter region including a TATA box. 6)                 The DNA fragment of the translated region of the bovine IGF2 gene was homologous to the bovine IGF2 mRNA sequence available in the GenBank database (X53553). Alignment with the already published mRNA sequence identified the non-homologous intron sequences 8 and 9 of the bovine IGF2 gene. 7)                 Methylation analyses revealed a similar low methylation level of introns 4 and 5 between oocyte and sperm DNA. In contrast, exon 10 was hypermethylated in sperm DNA (99%), but only low methylated in oocyte DNA (16%). 8)                 DNA methylation within exon 10 was low in bovine in vitro fertilized zygotes and decreased further in in vitro fertilized 4-cell embryos. 9)                 Day 7 expanded blastocysts collected in vivo, fertilized in vitro or cloned with female adult fibroblasts showed similar methylation patterns. The level of methylation was higher in expanded blastocysts than in 4-cell stage embryos. 10)             Bisulfite sequencing revealed an increased and low methylation level within exon 10 in androgenetic and parthenogenetic expanded blastocysts, respectively. Female and male adult fibroblasts were both heavily methylated. 11)             Interestingly, male cloned blastocysts were hypermethylated compared to their female counterparts. The relative amounts of transcriptional products of the IGF2, IGF2R and MASH2 genes detected in in vitro fertilized and parthenogenetic blastocysts indicate bi-allelic gene expression during bovine preimplantation development. Gene expression activity was independent of the embryonic size. Exons 4 and 5 and introns 4 and 5 identified within the bovine IGF2 gene are highly conserved among mammals and support the hypothesis of ROTWEIN and HALL (1990) that sequence and structure of the IGF2 gene were developed prior to the evolutionary dispersion of mammals. A Differentially Methylated Region (DMR) was identified in exon 10 of the bovine IGF2 gene. This final exon of the gene was hypermethylated in sperm DNA but low methylated in oocyte DNA. It is assumed that the bovine intragenic DMR corresponds to the DMR2 of the murine Igf2 gene due to high sequence conservation between different mammalian species. The intragenic DMR2 is demethylated after fertilization on the paternally methylated chromosome as it is described in the mouse. Unlike the mouse, demethylation is completed at the 4-cell stage of bovine embryonic development. Bovine day 7 expanded blastocysts are in an identical manner remethylated irrespective of the different origins. Thus, the in vitro production protocols had no effect on the methylation reprogramming. In contrast, hypermethylation of male cloned blastocysts is indicative for insufficient reprogramming and a sex specific methylation reprogramming is suggested. Androgenetic and parthenogenetic expanded blastocysts and adult fibroblasts showed the expected methylation levels. The DMR is low methylated in parthenogenetic embryos due to their two maternal genomes but highly methylated in androgenetic embryos (two paternal genomes). Somatic cells are often hypermethylated. A Differentially Methylated Region was identified for the first time in the bovine IGF2 gene. In addition, this is the first study on analyses of methylation patterns of the bovine IGF2 gene in preimplantation embryos. Results demonstrate that the determination of methylation levels can be used as a diagnostic tool to detect aberrations in methylation reprogramming of in vitro produced embryos.

Die Methylierung der DNA an Cytosinmolekülen ist einer der am besten verstandenen Mechanismen innerhalb des epigenetischen Phänomens Imprinting. Gene, die dem Imprinting unterliegen, spielen eine bedeutende Rolle während der embryonalen Säugerentwicklung. Die meisten Erkenntnisse über das Imprinting stammen aus Untersuchungen an Mäusen und humanen Zellen. Informationen über das Imprinting bei landwirtschaftlichen Nutztieren gibt es dagegen nur wenige. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der DNA-Methylierung des Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor2-Gens (IGF2) in bovinen Keimzellen und präimplantatorischen Embryonen. Zusätzlich wurden Genexpressionsanalysen des IGF2, des Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor2 Rezeptor-Gens (IGF2R) und des Mammalian achaete-scute homolog2-Gens (MASH2) in Rinderblastozysten durchgeführt. Die Expressionsmuster von bovinen in vitro fertilisierten (IVF) oder parthenogenetischen (PA) Blastozysten und expandierten Blastozysten an Tag 7 wurden mittels semi-quantitativer RT-PCR ermittelt. Die In-vitro-Kultur der Embryonen erfolgte im halbdefinierten SOF/BSA-Medium (Synthetic Oviduct Fluid/Bovine Serum Albumin). Über die Ermittlung des relativen Gehalts an Transkriptionsprodukten kann indirekt auf eine tendentiell mono- oder biallelische Genexpression geschlossen werden. Paternal exprimierte Gene würden dabei einen erhöhten relativen mRNA Gehalt in in vitro fertilisierten (mütterliches und väterliches Genom) im Vergleich zu parthenogenetischen Embryonen aufweisen. Dagegen würden maternal exprimierte Gene eine erhöhte relative Menge an Transkriptions-produkten in parthenogenetischen Embryonen (diploides mütterliches Genom) im Vergleich zu IVF-Embryonen beinhalten. In die Analysen wurden geschlüpfte IVF- und PA-Blastozysten, in vivo gewonnene Blastozysten, ICM- (Innere Zellmasse) und Trophektodermzellen mit einbezogen. ICM- und Trophektoderm-zellen wurden aus in vitro fertilisierten und parthenogenetischen Blastozysten isoliert und die jeweiligen Zellzahlen mittels der Differential Staining-Methode ermittelt. Außerdem wurde die Größe der Blastozysten gemessen. Für die Analysen der Methylierungsmuster in bovinen Keimzellen und präimplantatorischen Embryonen war es zunächst notwendig, genomische Sequenzen des bovinen IGF2-Gens zu identifizieren. Von landwirtschaftlichen Nutztieren stehen nur wenige molekulare Informationen zur Verfügung. Zu Beginn dieser Arbeit war nur die mRNA-Sequenz des bovinen IGF2-Gens in der Datenbank zugänglich. Es wurden zunächst zwei Fragmente innerhalb der nicht translatierten Region aus boviner Gewebe-DNA amplifiziert. Primer für die PCR konnten aus der veröffentlichten Sequenz des ovinen IGF2-Gens abgeleitet werden. Intronsequenzen der translatierten Region wurden ebenfalls durch PCR-Amplifizierung identifiziert. Die Primerpaare dafür wurden aus der in der Datenbank veröffentlichten mRNA-Sequenz ermittelt. Analysen zum Methylierungsmuster beider Fragmente der nicht trans-latierten Region sowie des Exons 10 wurden mit in vitro gereiften Eizellen und kryokonservierten Spermien durchgeführt. In präimplantatorischen Rinderembryonen verschiedener Herkunft wurden 27 CG-Dinukleotide innerhalb des Exons 10 mittels Bisulfitsequenzierung untersucht. Adulte Fibroblasten, die als somatische Spender-zellen für die Erstellung der geklonten Embryonen dienten, wurden ebenfalls in die Untersuchungen mit einbezogen. Die Bisulfitsequenzierung ist eine sehr sensitive Methode, um methylierte und nicht methylierte Cytosinmoleküle zu analysieren. Die Methode beruht dabei auf der Fähigkeit von Bisulfit nicht methylierte Cytosinmoleküle in Uracil umzuwandeln. Diese erscheinen nach einer PCR-Amplifizierung als Thymin. Methylierte Cytosinmoleküle gehen unverändert als Cytosine aus der Reaktion hervor. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: 1)                 Die Zellzahlen in vitro fertilisierter und parthenogenetischer Blastozysten (<180 µm) und expandierter Blastozysten (>180 µm) wurden mittels der Differential Staining-Methode ermittelt. Sie waren in Embryonen beider In-vitro-Protokolle ähnlich. Eine erhöhte Anzahl an Zellen (p≤0.05) in expandierten IVF-Blastozysten konnte der größeren Zahl an Trophekto-dermzellen zugeschrieben werden. 2)                 Kein Unterschied konnte in der Expression der bovinen IGF2- und IGF2R-Gene in expandierten IVF-und PA-Blastozysten detektiert werden. Allerdings wurde ein erhöhter relativer Gehalt an Transkriptionsprodukten des MASH2-Gens in IVF-Blastozysten gegenüber parthenogenetischen Embryonen nachgewiesen (p≤0.05). 3)                 Die Analysen mittels semi-quantitativer RT-PCR wurden auf in vitro und in vivo gewonnene Blastozysten sowie isolierte ICM- und Trophektoderm-zellen ausgedehnt. Im Gegensatz zu parthenogenetischen konnte in expandierten in vitro fertilisierten Blastozysten ein erhöhter relativer Gehalt an IGF2-mRNA ermittelt werden (p≤0.05). Das IGF2R-Gen wurde vor allem in ICM-Zellen aus expandierten IVF-Blastozysten sowie in geschlüpften parthenogenetischen Blastozysten exprimiert (p≤0.05). Geschlüpfte Blastozysten beider Protokolle exprimierten ähnliche relative mRNA-Mengen des bovinen IGF2R-Gens. 4)                 Beide Fragmente, die innerhalb der nicht translatierten Region des bovinen IGF2-Gens sequenziert wurden, waren zu >90% homolog zu den Exons und Introns 4 und 5 des ovinen IGF2-Gens. 5)                 Sowohl im bovinen Intron 4 als auch im Intron 5 wurden CpG-Inseln ermittelt. Außerdem beinhaltet die Sequenz des Intron 5 eine Promoter-region mit einer TATA-Box. 6)                 Die DNA-Fragmente der translatierten Region wurden als Intron 8 und 9 des bovinen IGF2 Gens identifiziert. Homologien konnten nur mit mRNA-Sequenzen verschiedener Spezies, einschließlich der bekannten bovinen mRNA-Sequenz (X53553) ermittelt werden. Nicht homologe Sequenz-abschnitte des DNA-Fragments wurden deshalb als Intronsequenzen angesehen. 7)                 DNA aus Eizellen und Spermien war innerhalb der Sequenzabschnitte von Intron 4 und 5 nur wenig methyliert. Dagegen war die untersuchte Sequenz des Exons 10 hypermethyliert in Spermien-DNA (99%) und gering methyliert (16%) in DNA aus Oozyten. 8)                 Die Methylierung der DNA im Bereich des Exon 10 war in Zygoten aus In-vitro-Fertilisierung gering. Der Methylierungsgrad innerhalb dieses Frag-ments verringerte sich zusätzlich im 4-Zellstadium. 9)                 Expandierte Blastozysten (Tag 7) unterschieden sich unabhängig von ihrer jeweiligen Erstellung (IVF, in vivo oder geklonte weibliche Blastozysten) nur wenig im Methylierungsmuster innerhalb des letzten IGF2-Exons. Der Methylierungsgrad war allerdings höher als in Embryonen des 4-Zell-stadiums. 10)             Exon 10 des bovinen IGF2-Gens war in androgenetischen Blastozysten stärker methyliert als in parthenogenetischen Embryonen. Keine Unterschiede konnten im Methylierungsgehalt der DNA zwischen männlichen und weiblichen adulten Fibroblasten nachgewiesen werden, beide waren hypermethyliert. 11)             DNA männlicher geklonter Blastozysten war erstaunlicherweise innerhalb des Exon 10 stärker methyliert als Blastozysten, die mit weiblichen adulten Fibroblasten erstellt wurden. Rinderblastozysten scheinen die Gene IGF2, IGF2R und MASH2 von jeweils beiden elterlichen Allelen während der Präimplantationsentwicklung zu exprimieren. Dabei war die relative Menge an Transkriptionsprodukten unabhängig von der Embryonengröße. Die Sequenzen der Exons und Introns 4 und 5 des bovinen IGF2 Gens unterscheiden sich nur wenig von denen anderer Säugerspezies. Dies entspricht der Hypothese von ROTWEIN und HALL (1990), dass sich sowohl die Sequenz wie auch die Struktur des IGF2-Gens bereits vor der evolutionären Säugetieraufsplitterung entwickelt haben muß. Im Exon 10 des bovinen IGF2-Gens wurde eine differentiell methylierte Region (DMR) nachgewiesen. Die Exonsequenz ist in DNA aus Spermien hyper-, in Eizell-DNA hypomethyliert. Aufgrund der eindeutigen Sequenzhomologien zwischen verschiedenen Säugetierspezies wird davon ausgegangen, dass der innerhalb des bovinen IGF2-Gens identifizierte DMR dem DMR2 des murinen Igf2-Gens entspricht. Wie bereits aus Untersuchungen am murinen Igf2-Gen bekannt ist, wird der innerhalb des bovinen IGF2-Gens gelegene DMR nach der Befruchtung demethyliert. Im Gegensatz zur Maus ist diese Demethylierung in Rinderembryonen erst im 4-Zellstadium abgeschlossen. Expandierte Rinderblastozysten (Tag 7) werden unab-hängig von ihrer Erstellungsmethode gleichmäßig remethyliert. Die Protokolle zur Erstellung der verschiedenen Embryonen scheinen keinen Einfluß auf die Reprogrammierung der Methylierungsmuster nach der Befruchtung/Aktivierung gehabt zu haben. Allerdings deutet der erhöhte Methylierungsgehalt in geklonten männlichen Blastozysten auf eine unzureichende Reprogrammierung des Methylierungs-musters während der In-vitro-Kultur hin. Die Reprogrammierung des embryonalen Genoms könnte in geklonten Rinderembryonen geschlechtsspezifisch reguliert werden. DNA aus androgenetischen Blastozysten war aufgrund des doppelten männlichen Chromosomensatzes hypermethyliert, dagegen konnte nur ein geringer Methylierungsgehalt in parthenogenetischen Blastozysten nachgewiesen werden. Somatische Zellen zeigen häufig einen erhöhten Methylierungsgehalt. Erstmals konnte beim Rind eine differentiell methylierte Region innerhalb eines Genes, das dem Imprinting unterliegt, nachgewiesen werden. Innerhalb dieses Forschungsprojektes konnten auch erstmalig Methylierungsmuster des bovinen IGF2-Gens in präimplantatorischen Embryonen, die nach verschiedenen Protokollen erstellt wurden, analysiert werden. Die Ergebnisse zeigen, dass der Nachweis von Methylierungsmustern diagnostisch für die Erkennung einer unzureichenden embryonalen Reprogrammierung in in vitro produzierten Rinderembryonen eingesetzt werden kann.

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Gebert, Claudia Maria: Characterization of gene expression and methylation patterns of the bovine IGF2 gene in gametes and preimplantation embryos of different origins. Hannover 2005. Tierärztliche Hochschule.

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