Characterization of gene expression and methylation patterns of the bovine IGF2 gene in gametes and preimplantation embryos of different origins

Die Methylierung der DNA an Cytosinmolekülen ist einer der am besten verstandenen Mechanismen innerhalb des epigenetischen Phänomens Imprinting. Gene, die dem Imprinting unterliegen, spielen eine bedeutende Rolle während der embryonalen Säugerentwicklung. Die meisten Erkenntnisse über das Imprinting stammen aus Untersuchungen an Mäusen und humanen Zellen. Informationen über das Imprinting bei landwirtschaftlichen Nutztieren gibt es dagegen nur wenige. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der DNA-Methylierung des Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor2-Gens (IGF2) in bovinen Keimzellen und präimplantatorischen Embryonen. Zusätzlich wurden Genexpressionsanalysen des IGF2, des Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor2 Rezeptor-Gens (IGF2R) und des Mammalian achaete-scute homolog2-Gens (MASH2) in Rinderblastozysten durchgeführt. Die Expressionsmuster von bovinen in vitro fertilisierten (IVF) oder parthenogenetischen (PA) Blastozysten und expandierten Blastozysten an Tag 7 wurden mittels semi-quantitativer RT-PCR ermittelt. Die In-vitro-Kultur der Embryonen erfolgte im halbdefinierten SOF/BSA-Medium (Synthetic Oviduct Fluid/Bovine Serum Albumin). Über die Ermittlung des relativen Gehalts an Transkriptionsprodukten kann indirekt auf eine tendentiell mono- oder biallelische Genexpression geschlossen werden. Paternal exprimierte Gene würden dabei einen erhöhten relativen mRNA Gehalt in in vitro fertilisierten (mütterliches und väterliches Genom) im Vergleich zu parthenogenetischen Embryonen aufweisen. Dagegen würden maternal exprimierte Gene eine erhöhte relative Menge an Transkriptions-produkten in parthenogenetischen Embryonen (diploides mütterliches Genom) im Vergleich zu IVF-Embryonen beinhalten. In die Analysen wurden geschlüpfte IVF- und PA-Blastozysten, in vivo gewonnene Blastozysten, ICM- (Innere Zellmasse) und Trophektodermzellen mit einbezogen. ICM- und Trophektoderm-zellen wurden aus in vitro fertilisierten und parthenogenetischen Blastozysten isoliert und die jeweiligen Zellzahlen mittels der Differential Staining-Methode ermittelt. Außerdem wurde die Größe der Blastozysten gemessen. Für die Analysen der Methylierungsmuster in bovinen Keimzellen und präimplantatorischen Embryonen war es zunächst notwendig, genomische Sequenzen des bovinen IGF2-Gens zu identifizieren. Von landwirtschaftlichen Nutztieren stehen nur wenige molekulare Informationen zur Verfügung. Zu Beginn dieser Arbeit war nur die mRNA-Sequenz des bovinen IGF2-Gens in der Datenbank zugänglich. Es wurden zunächst zwei Fragmente innerhalb der nicht translatierten Region aus boviner Gewebe-DNA amplifiziert. Primer für die PCR konnten aus der veröffentlichten Sequenz des ovinen IGF2-Gens abgeleitet werden. Intronsequenzen der translatierten Region wurden ebenfalls durch PCR-Amplifizierung identifiziert. Die Primerpaare dafür wurden aus der in der Datenbank veröffentlichten mRNA-Sequenz ermittelt. Analysen zum Methylierungsmuster beider Fragmente der nicht trans-latierten Region sowie des Exons 10 wurden mit in vitro gereiften Eizellen und kryokonservierten Spermien durchgeführt. In präimplantatorischen Rinderembryonen verschiedener Herkunft wurden 27 CG-Dinukleotide innerhalb des Exons 10 mittels Bisulfitsequenzierung untersucht. Adulte Fibroblasten, die als somatische Spender-zellen für die Erstellung der geklonten Embryonen dienten, wurden ebenfalls in die Untersuchungen mit einbezogen. Die Bisulfitsequenzierung ist eine sehr sensitive Methode, um methylierte und nicht methylierte Cytosinmoleküle zu analysieren. Die Methode beruht dabei auf der Fähigkeit von Bisulfit nicht methylierte Cytosinmoleküle in Uracil umzuwandeln. Diese erscheinen nach einer PCR-Amplifizierung als Thymin. Methylierte Cytosinmoleküle gehen unverändert als Cytosine aus der Reaktion hervor. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: 1)                 Die Zellzahlen in vitro fertilisierter und parthenogenetischer Blastozysten (<180 µm) und expandierter Blastozysten (>180 µm) wurden mittels der Differential Staining-Methode ermittelt. Sie waren in Embryonen beider In-vitro-Protokolle ähnlich. Eine erhöhte Anzahl an Zellen (p≤0.05) in expandierten IVF-Blastozysten konnte der größeren Zahl an Trophekto-dermzellen zugeschrieben werden. 2)                 Kein Unterschied konnte in der Expression der bovinen IGF2- und IGF2R-Gene in expandierten IVF-und PA-Blastozysten detektiert werden. Allerdings wurde ein erhöhter relativer Gehalt an Transkriptionsprodukten des MASH2-Gens in IVF-Blastozysten gegenüber parthenogenetischen Embryonen nachgewiesen (p≤0.05). 3)                 Die Analysen mittels semi-quantitativer RT-PCR wurden auf in vitro und in vivo gewonnene Blastozysten sowie isolierte ICM- und Trophektoderm-zellen ausgedehnt. Im Gegensatz zu parthenogenetischen konnte in expandierten in vitro fertilisierten Blastozysten ein erhöhter relativer Gehalt an IGF2-mRNA ermittelt werden (p≤0.05). Das IGF2R-Gen wurde vor allem in ICM-Zellen aus expandierten IVF-Blastozysten sowie in geschlüpften parthenogenetischen Blastozysten exprimiert (p≤0.05). Geschlüpfte Blastozysten beider Protokolle exprimierten ähnliche relative mRNA-Mengen des bovinen IGF2R-Gens. 4)                 Beide Fragmente, die innerhalb der nicht translatierten Region des bovinen IGF2-Gens sequenziert wurden, waren zu >90% homolog zu den Exons und Introns 4 und 5 des ovinen IGF2-Gens. 5)                 Sowohl im bovinen Intron 4 als auch im Intron 5 wurden CpG-Inseln ermittelt. Außerdem beinhaltet die Sequenz des Intron 5 eine Promoter-region mit einer TATA-Box. 6)                 Die DNA-Fragmente der translatierten Region wurden als Intron 8 und 9 des bovinen IGF2 Gens identifiziert. Homologien konnten nur mit mRNA-Sequenzen verschiedener Spezies, einschließlich der bekannten bovinen mRNA-Sequenz (X53553) ermittelt werden. Nicht homologe Sequenz-abschnitte des DNA-Fragments wurden deshalb als Intronsequenzen angesehen. 7)                 DNA aus Eizellen und Spermien war innerhalb der Sequenzabschnitte von Intron 4 und 5 nur wenig methyliert. Dagegen war die untersuchte Sequenz des Exons 10 hypermethyliert in Spermien-DNA (99%) und gering methyliert (16%) in DNA aus Oozyten. 8)                 Die Methylierung der DNA im Bereich des Exon 10 war in Zygoten aus In-vitro-Fertilisierung gering. Der Methylierungsgrad innerhalb dieses Frag-ments verringerte sich zusätzlich im 4-Zellstadium. 9)                 Expandierte Blastozysten (Tag 7) unterschieden sich unabhängig von ihrer jeweiligen Erstellung (IVF, in vivo oder geklonte weibliche Blastozysten) nur wenig im Methylierungsmuster innerhalb des letzten IGF2-Exons. Der Methylierungsgrad war allerdings höher als in Embryonen des 4-Zell-stadiums. 10)             Exon 10 des bovinen IGF2-Gens war in androgenetischen Blastozysten stärker methyliert als in parthenogenetischen Embryonen. Keine Unterschiede konnten im Methylierungsgehalt der DNA zwischen männlichen und weiblichen adulten Fibroblasten nachgewiesen werden, beide waren hypermethyliert. 11)             DNA männlicher geklonter Blastozysten war erstaunlicherweise innerhalb des Exon 10 stärker methyliert als Blastozysten, die mit weiblichen adulten Fibroblasten erstellt wurden. Rinderblastozysten scheinen die Gene IGF2, IGF2R und MASH2 von jeweils beiden elterlichen Allelen während der Präimplantationsentwicklung zu exprimieren. Dabei war die relative Menge an Transkriptionsprodukten unabhängig von der Embryonengröße. Die Sequenzen der Exons und Introns 4 und 5 des bovinen IGF2 Gens unterscheiden sich nur wenig von denen anderer Säugerspezies. Dies entspricht der Hypothese von ROTWEIN und HALL (1990), dass sich sowohl die Sequenz wie auch die Struktur des IGF2-Gens bereits vor der evolutionären Säugetieraufsplitterung entwickelt haben muß. Im Exon 10 des bovinen IGF2-Gens wurde eine differentiell methylierte Region (DMR) nachgewiesen. Die Exonsequenz ist in DNA aus Spermien hyper-, in Eizell-DNA hypomethyliert. Aufgrund der eindeutigen Sequenzhomologien zwischen verschiedenen Säugetierspezies wird davon ausgegangen, dass der innerhalb des bovinen IGF2-Gens identifizierte DMR dem DMR2 des murinen Igf2-Gens entspricht. Wie bereits aus Untersuchungen am murinen Igf2-Gen bekannt ist, wird der innerhalb des bovinen IGF2-Gens gelegene DMR nach der Befruchtung demethyliert. Im Gegensatz zur Maus ist diese Demethylierung in Rinderembryonen erst im 4-Zellstadium abgeschlossen. Expandierte Rinderblastozysten (Tag 7) werden unab-hängig von ihrer Erstellungsmethode gleichmäßig remethyliert. Die Protokolle zur Erstellung der verschiedenen Embryonen scheinen keinen Einfluß auf die Reprogrammierung der Methylierungsmuster nach der Befruchtung/Aktivierung gehabt zu haben. Allerdings deutet der erhöhte Methylierungsgehalt in geklonten männlichen Blastozysten auf eine unzureichende Reprogrammierung des Methylierungs-musters während der In-vitro-Kultur hin. Die Reprogrammierung des embryonalen Genoms könnte in geklonten Rinderembryonen geschlechtsspezifisch reguliert werden. DNA aus androgenetischen Blastozysten war aufgrund des doppelten männlichen Chromosomensatzes hypermethyliert, dagegen konnte nur ein geringer Methylierungsgehalt in parthenogenetischen Blastozysten nachgewiesen werden. Somatische Zellen zeigen häufig einen erhöhten Methylierungsgehalt. Erstmals konnte beim Rind eine differentiell methylierte Region innerhalb eines Genes, das dem Imprinting unterliegt, nachgewiesen werden. Innerhalb dieses Forschungsprojektes konnten auch erstmalig Methylierungsmuster des bovinen IGF2-Gens in präimplantatorischen Embryonen, die nach verschiedenen Protokollen erstellt wurden, analysiert werden. Die Ergebnisse zeigen, dass der Nachweis von Methylierungsmustern diagnostisch für die Erkennung einer unzureichenden embryonalen Reprogrammierung in in vitro produzierten Rinderembryonen eingesetzt werden kann.