Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Experimentelle Untersuchungen zur Herstellung einer bioartifiziellen Trachea

Giere, Bettina

The goal of this project was to develop chondrocyte culture techniques for tissue engineering of a bioartificial trachea. The cultivation of primary chondrocytes on a three dimensional biological matrix in brooch shape should stabilise a flexible, tubular tracheal graft. For the standardisation of cell-harvesting and –cultivation of adult chondrocytes the following pilot studies were performed: 1. Cell isolation was optimized by using different enzymatical digestion times (5h, 8h and 14h) of native tissue. 2. Metabolic characterisation of different chondrocytes sub-types (ear, rip, trachea) cultured in a 2-D culture system was used to determine the adequate cell source. 3. The cell compatibility of the liquid matrix and the applicability as a seeding ground for chondrocytes was checked in culture experiments and LIVE/DEAD vitality assay. 4. Three different production techniques for the generation of liquid matrix by using varying enzymes and there concentrations were determined in culture experiments over 4 weeks by analysing cellular metabolism. 5. The ideal seeding density for the first main experiment was defined by cell metabolism tests in 3-D cultures consisting of chondrocytes and liquid matrix. In three main experiments three-dimensional chondrocyte culture techniques were tested: 1. Experiment: Comparison of 2-D and 3-D culture techniques To study the dedifferentiation behaviour of chondrocytes in the liquid matrix and the capability of this matrix to function as a three-dimensional culture system, the cells were cultured with and without liquid matrix over 4 weeks. The tissue was checked weekly for metabolism, glucosamnioglycane production, collagen production and histological formation. The advantage of the liquid matrix is its enabling of reproduction of a brooch. 2. Experiment: Simple 3-D culture technique The transferability of the liquid matrix into a different culture system was examined. Two seeding techniques were varied, the sandwich- and the injection-seeding technique. In the sandwich-seeding a mixture of cells and liquid matrix was cultivated between two layers of acellular small bowl-segments (SIS). In the injection-seeding the cell-matrix-suspension was injected into acellular small bowl-wall. Both culture systems allow to cut out cartilage brooches after a successful seeding procedure. In the generated tissue cell vitality, cell metabolism and histological composition were determined. 3. Experiment: Complex 3-D culture technique Chondrocytes were seeded directly on a flexible tubular matrix generated from acellular porcine small bowl to increase matrix stability over time. Cultivation lasted three weeks in a bioreactor system with luminal medium perfusion. The tissue was characterized by cell vitality tests, cell metabolism tests, glucosaminoglycan assay, collagen verifications and histology. The following results were obtained: Pilot studies 1. The most effective cell yield of vital chondrocytes was obtained after an 8 hour digestion of native cartilage with 0,2 % collagenase of type II. 2. There was no intrinsic difference between the metabolic activity of the three tested chondrocytes sub-types (ear, rip, trachea). Because of the contamination potential of ear tissue most experiments were continued with rip cartilage 3. The LIVE/DEAD viability assay proved the cell vitality cultured in liquid matrix qualitatively. 4. In the culturing experiments chondrocytes cultured in liquid matrix processed with 0,1 % Collagenase type II showed the highest metabolic cell activity in the O2-measurement and in the MTT-test and a significant higher glucosaminolglycan syntheses (p<0,005). 5. In the cell proliferation assay the most effective cellular metabolism activity was reached at a cell density of 500 000 cells/ cm2. Main experiments 1. Experiment: Comparison of 2-D and 3-D culture techniques The mechanical stability of tissue from 2-D and 3-D cultures increased over time and facilitated handling with forceps after the 14th culture day. The transmitted light microscopy showed a round cell shape over 4 weeks. The course of the cell metabolism was the same in both culture techniques but the metabolism was lower in the 3-D culture (p<0,005). The glucosaminoglycane production for the 3-D culture system was significantly higher (p=0,02). The Westernblots did not show collagen type I and collagen type III, but collagen type II. The PCR results showed a collagen type I and II expression on the 7th day. Histological staining confirmed the generation of cartilage-like tissue with mineralization starting to occur. 2. Experiment: Simple 3-D culture technique Injection seeding technique resulted in no successful seeding. The sandwich seeding technique lead to two successful experiments, but they were not reproducible. The tissue stability was increased macroscopically. Cartilage-like tissue was seen histologically with starting to occur mineralization. The cells were vital over a period of 6,5 weeks and a round cell morphology was proven microscopically. 3. Experiment: Complexe 3-D culture technique ECM synthesis was apparent on the tubular matrix after three weeks of cultivation, but there was no increase in tissue stability. The cells were viable. The cellular metabolism correlated with a high glucosamnioglycane-production. In the Westernblot there was no evidence for a collagen type I and III production. An inconstant collagen type II synthesis was documented in this experiments. The pilot studies served to optimize chondrocyte isolation, liquid matrix generation and additional experimental conditions. The development of the liquid matrix enabled the establishment of a three dimensional cell culture system. There was no evidence of a marked chondrocyte dedifferentiation cultured in the liquid matrix using the applied detection methods. The simple 3-D culture technique generated a cartilage-like tissue which was not reproducible in further studies. In the last experiment chondrocytes could be seeded directly on greater tubular matrix. The stiffness of the produced cartilage was not satisfactory enough to stabilize a flexible tracheal graft in all three experiments. Improvement of the bioreactor technology is necessary to afford the a physiological cell environment resulting in a tissue substitution with an adequate mechanical capacity. This work represents the first steps towards the development of tissue engineered tracheal substitutes for clinical application.

Zielsetzung dieser Arbeit war es, mit den Methoden des Tissue Engineering in-vitro Knorpelzellkulturverfahren zur Herstellung einer bioartifiziellen Trachea zu entwickeln. Die Kultivierung primärer Chondrozyten in einer dreidimensionalen biologischen Matrix, idealer weise in Spangenform, sollte der Stabilisierung einer flexiblen Luftröhrenprothese dienen. Zur Standardisierung der Zellgewinnung, -isolation und -kultivierung von primären adulten Knorpelzellen wurden folgende Vorversuche durchgeführt: 1. Die Effektivität der Zellisolation wurde anhand verschiedener enzymatischer Verdauungszeiten (5h, 8h und 14h) des nativen Knorpelgewebes optimiert. 2. Eine Auswahl der geeigneten Zellquelle wurde über die Darstellung der Stoffwechselaktivität der verschiedenen Knorpelzelltypen (Ohr, Rippe und Trachea) in der 2-D Kultur getroffen. 3. Die als Besiedlungsgrundlage für die Knorpelzellen vorgesehene flüssige Matrix wurde in Besiedlungsversuchen auf ihre Zellverträglichkeit durch die Überprüfung der Zellvitalität getestet. 4. In drei enzymatische Herstellungsverfahren zur Gewinnung der flüssigen Matrix wurden Enzyme und Enzymkonzentrationen variiert und in Besiedlungsexperimenten über 4 Wochen und in Stoffwechselanalysen getestet. 5. Die ideale Besiedlungsdichte für das folgende 1. Hauptexperiment in 3-D Kulturen, bestehend aus Knorpelzellen und flüssiger Matrix, wurde über Stoffwechselaktivität ermittelt. In drei Hauptexperimenten wurden Verfahren zur dreidimensionalen Knorpelzellkultivierung getestet. 1. Experiment: Vergleich zwischen 2-D und 3-D Kulturverfahren Vergleichend zur Beobachtung des Dedifferenzierungsverhaltens der Zellen in der flüssigen Matrix und zur Eignung der flüssigen Matrix als 3-D Kultur wurden Knorpelzellen mit und ohne flüssige Matrix über 4 Wochen unter den gleichen Versuchsbedingungen kultiviert. Im wöchentlichen Abstand wurden die Gewebe auf ihre Stoffwechselaktivität, die Glucosaminoglykanproduktion, die Kollagenproduktion und den histologischen Aufbau untersucht. Die flüssige Matrix hätte den Vorteil der freien Formgestaltung und somit wäre eine Nachahmung der Spangenform möglich. 2. Experiment: Einfaches 3-D Kulturverfahren In den dazu parallel durchgeführten Versuchen zur einfachen 3-D Kultur wurde die Übertragbarkeit der flüssigen Matrix in ein anderes Kultursystem getestet. Es wurden zwei Besiedlungstechniken variiert, die Sandwich- und die Injektions-Besiedlungstechnik. Bei der Sandwichbesiedlung wurde ein Gemisch aus Zellen und flüssiger Matrix zwischen zwei Lagen azellularisiertem Darm (SIS) eingeschlossen und bei der Injektionsbesiedlung wurde das Gemisch zwischen die Lagen einer azellularisiertem Darmwand injiziert. Diese Systeme ermöglichen nach erfolgreicher Besiedlung ein Herausschneiden von Knorpelspangen. Die generierten Gewebe wurden auf Zellvitalität, Stoffwechselaktivität und auf ihre histologische Zusammensetzung hin untersucht. 3. Experiment: Komplexes 3-D Kulturverfahren In der letzten Experimentserie, dem komplexen 3-D Kulturverfahren, wurden Knorpelzellen direkt auf eine tubuläre flexible Matrix aus azellulärem porcinem Darm (SIS) aufgebracht, um diese im Laufe der Kultivierung zu verfestigen. Die Kultivierung wurde 3 Wochen in einem Bioreaktorsystem mit luminaler Mediumperfusion durchgeführt. Anschließend wurde das generierte Gewebe aufgearbeitet und auf Zellvitalität, Stoffwechselaktivität, Glucosaminoglykan-produktion, Kollagenproduktion und histologische Zusammensetzung hin untersucht. Folgende Ergebnisse wurden erarbeitet: Vorversuche 1. Am effektivsten war die Ausbeute vitaler Chondrozyten nach einer 8-stündigen enzymatischen Verdauung des nativen Knorpelgewebes mit 0,2 %iger Kollagenase vom Typ II. 2. In der Stoffwechselaktivität der drei Knorpelzellquellen (Ohr, Rippe und Trachea) konnten keine wesentlichen Unterschiede ermittelt werden. Aufgrund des hohen Kontaminationspotenzials der Zellkulturen durch die Verwendung von Ohrknorpelgewebe wurden die überwiegende Anzahl der Versuche mit Rippenknorpelzellen vorgenommen. 3. In Besiedlungsversuchen der flüssigen Matrix mit Chondrozyten konnte im LIVE/DEAD Viability Assay Kit qualitativ die Vitalität der Zellen belegt werden. 4. Bei der Kultivierung der Chondrozyten in der flüssigen Matrix aus den 3 verschiedenen Herstellungsansätzen, zeigten die Kulturen des Ansatzes unter Verwendung der 0,1 %igen Kollagenase vom Typ II die höchste Stoffwechselaktivität. Dies bezieht sich sowohl auf die Sauerstoffmessung als auch auf den Cell Proliferation Assay. Die Glucosaminoglykanproduktion lag signifikant über dem der anderen beiden Herstellungsansätze (p<0,005). 5. Im Stoffwechselaktivitätstest konnte bei einer Besiedlungsdichte von 500 000 Zellen/cm2 die effektivste metabolische Aktivität ermittelt werden. Hauptexperimente 1. Experiment: Vergleich zwischen 2-D und 3-D Kulturverfahren Das Gewebe der 2-D und 3-D Kulturen war ab dem 14. Kulturtag fest und mit einer Pinzette herausnehmbar. In der Mikroskopie konnte eine runde Zellmorphologie der Chondrozyten in der 2-D und in der 3-D Kultur über 4 Wochen belegt werden. Der Verlauf der Stoffwechselaktivität war in der 2-D Kultur gleich dem Verlauf der 3-D Kultur, doch die Höhe der metabolischen Aktivität lag in der 3-D Kultur unter der der 2-D Kultur (p<0,005). Die Glucosaminoglykansynthese lag in der 3-D Kultur signifikant über der der 2-D Kultur (p=0,002). Im Westernblot konnte für die 2-D und die 3-D Kultur kein Kollagen vom Typ I und III nachgewiesen werden, doch wurde Kollagen vom Typ II nachgewiesen. Mit der PCR war bis zum Tag 7 der Kultivierung eine Kollagen Typ I und II Produktion nachweisbar. Die Auswertung der histologischen Übersichtsfärbungen zeigten knorpelähnliches Gewebe und die Spezialfärbung eine beginnende Mineralisation der ECM. 2. Experiment: Einfaches 3-D Kulturverfahren Unter Verwendung der Injektions-Besiedlungstechnik gelangen keine erfolgreichen Besiedlungen. Bei der Sandwich-Besiedlungstechnik kam es zu zwei gelungenen Besiedlungen, die sich nicht reproduzieren ließen. In den Besiedlungen hatte sich das Gewebe makroskopisch verfestigt und histologisch konnte knorpelähnliches Gewebe nachgewiesen werden. Die Zellen waren über einen Zeitraum von 6,5 Wochen vital und zeigten mikroskopisch eine runde Zellmorphologie. In der Pentachromfärbung gab es Hinweise auf eine beginnende Mineralisation. 3. Experiment: Komplexes 3-D Kulturverfahren Nach dreiwöchiger Kultivierung der Chondrozyten auf der tubulären Matrix war makroskopisch eine ECM Synthese sichtbar, eine Verfestigung der Matrix hatte nicht stattgefunden. Die Zellen zeigten eine deutliche Vitalität im Lebend-Tod-Test. Im MTT-Test konnte die Stoffwechselaktivität der Zellen belegt werden, die mit der Glucosaminoglykanproduktion korrelierte. Im Westernblot war keine Kollagen Typ I und III Produktion nachweisbar. Eine Kollagen Typ II Produktion war nur in 2 Bioreaktoren vorhanden. Mit Hilfe der Ergebnisse aus den Vorversuchen wurde die Knorpelzellgewinnung optimiert, das Herstellungsverfahren zur flüssigen Matrix verbessert und die Versuchsbedingungen für weitere Experimente festgelegt. Mit der Entwicklung der neuartigen, flüssigen Matrix gelang die Etablierung einer 3-D Knorpelzellkultur, die mit den durchgeführten Nachweismethoden keinen Hinweis auf eine ausgeprägte Dedifferenzierung der Zellen ergab. In der zweiten Versuchsserie zur 3-D Kultivierung im einfachen 3-D Kultursystem konnten zwar Chondrozyten kultiviert werden, aber die Ergebnisse waren nicht reproduzierbar. Das letzte Experiment zum komplexen 3-D Kulturverfahren im Bioreaktorsystem belegte die Besiedelbarkeit größerer tubulärer Matrices. In allen drei Experimenten war die Stabilität der gezüchteten Knorpelgewebe noch nicht ausreichend, um eine flexible Luftröhrenprothese, wie z. B. die BioVam?, bei der Ex- und Inspiration zu stützen. Es ist noch viel Optimierungsarbeit im Bereich der Bioreaktortechnologie notwendig, um den Zellen eine ihrer physiologischen Umgebung angepasste Atmosphäre zu bieten und so, ein dem nativen Knorpel ähnliches Ersatzgewebe mit ausreichender mechanischer Belastbarkeit zu erhalten. Mit dieser Arbeit werden erste Schritte zur Entwicklung eines trachealen Organersatzes mit den Methoden des Tissue Engineering für die klinische Anwendung aufgezeigt.

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Giere, Bettina: Experimentelle Untersuchungen zur Herstellung einer bioartifiziellen Trachea. Hannover 2005. Tierärztliche Hochschule.

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