Experimentelle Untersuchungen zur Herstellung einer bioartifiziellen Trachea

Zielsetzung dieser Arbeit war es, mit den Methoden des Tissue Engineering in-vitro Knorpelzellkulturverfahren zur Herstellung einer bioartifiziellen Trachea zu entwickeln. Die Kultivierung primärer Chondrozyten in einer dreidimensionalen biologischen Matrix, idealer weise in Spangenform, sollte der Stabilisierung einer flexiblen Luftröhrenprothese dienen. Zur Standardisierung der Zellgewinnung, -isolation und -kultivierung von primären adulten Knorpelzellen wurden folgende Vorversuche durchgeführt: 1. Die Effektivität der Zellisolation wurde anhand verschiedener enzymatischer Verdauungszeiten (5h, 8h und 14h) des nativen Knorpelgewebes optimiert. 2. Eine Auswahl der geeigneten Zellquelle wurde über die Darstellung der Stoffwechselaktivität der verschiedenen Knorpelzelltypen (Ohr, Rippe und Trachea) in der 2-D Kultur getroffen. 3. Die als Besiedlungsgrundlage für die Knorpelzellen vorgesehene flüssige Matrix wurde in Besiedlungsversuchen auf ihre Zellverträglichkeit durch die Überprüfung der Zellvitalität getestet. 4. In drei enzymatische Herstellungsverfahren zur Gewinnung der flüssigen Matrix wurden Enzyme und Enzymkonzentrationen variiert und in Besiedlungsexperimenten über 4 Wochen und in Stoffwechselanalysen getestet. 5. Die ideale Besiedlungsdichte für das folgende 1. Hauptexperiment in 3-D Kulturen, bestehend aus Knorpelzellen und flüssiger Matrix, wurde über Stoffwechselaktivität ermittelt. In drei Hauptexperimenten wurden Verfahren zur dreidimensionalen Knorpelzellkultivierung getestet. 1. Experiment: Vergleich zwischen 2-D und 3-D Kulturverfahren Vergleichend zur Beobachtung des Dedifferenzierungsverhaltens der Zellen in der flüssigen Matrix und zur Eignung der flüssigen Matrix als 3-D Kultur wurden Knorpelzellen mit und ohne flüssige Matrix über 4 Wochen unter den gleichen Versuchsbedingungen kultiviert. Im wöchentlichen Abstand wurden die Gewebe auf ihre Stoffwechselaktivität, die Glucosaminoglykanproduktion, die Kollagenproduktion und den histologischen Aufbau untersucht. Die flüssige Matrix hätte den Vorteil der freien Formgestaltung und somit wäre eine Nachahmung der Spangenform möglich. 2. Experiment: Einfaches 3-D Kulturverfahren In den dazu parallel durchgeführten Versuchen zur einfachen 3-D Kultur wurde die Übertragbarkeit der flüssigen Matrix in ein anderes Kultursystem getestet. Es wurden zwei Besiedlungstechniken variiert, die Sandwich- und die Injektions-Besiedlungstechnik. Bei der Sandwichbesiedlung wurde ein Gemisch aus Zellen und flüssiger Matrix zwischen zwei Lagen azellularisiertem Darm (SIS) eingeschlossen und bei der Injektionsbesiedlung wurde das Gemisch zwischen die Lagen einer azellularisiertem Darmwand injiziert. Diese Systeme ermöglichen nach erfolgreicher Besiedlung ein Herausschneiden von Knorpelspangen. Die generierten Gewebe wurden auf Zellvitalität, Stoffwechselaktivität und auf ihre histologische Zusammensetzung hin untersucht. 3. Experiment: Komplexes 3-D Kulturverfahren In der letzten Experimentserie, dem komplexen 3-D Kulturverfahren, wurden Knorpelzellen direkt auf eine tubuläre flexible Matrix aus azellulärem porcinem Darm (SIS) aufgebracht, um diese im Laufe der Kultivierung zu verfestigen. Die Kultivierung wurde 3 Wochen in einem Bioreaktorsystem mit luminaler Mediumperfusion durchgeführt. Anschließend wurde das generierte Gewebe aufgearbeitet und auf Zellvitalität, Stoffwechselaktivität, Glucosaminoglykan-produktion, Kollagenproduktion und histologische Zusammensetzung hin untersucht. Folgende Ergebnisse wurden erarbeitet: Vorversuche 1. Am effektivsten war die Ausbeute vitaler Chondrozyten nach einer 8-stündigen enzymatischen Verdauung des nativen Knorpelgewebes mit 0,2 %iger Kollagenase vom Typ II. 2. In der Stoffwechselaktivität der drei Knorpelzellquellen (Ohr, Rippe und Trachea) konnten keine wesentlichen Unterschiede ermittelt werden. Aufgrund des hohen Kontaminationspotenzials der Zellkulturen durch die Verwendung von Ohrknorpelgewebe wurden die überwiegende Anzahl der Versuche mit Rippenknorpelzellen vorgenommen. 3. In Besiedlungsversuchen der flüssigen Matrix mit Chondrozyten konnte im LIVE/DEAD Viability Assay Kit qualitativ die Vitalität der Zellen belegt werden. 4. Bei der Kultivierung der Chondrozyten in der flüssigen Matrix aus den 3 verschiedenen Herstellungsansätzen, zeigten die Kulturen des Ansatzes unter Verwendung der 0,1 %igen Kollagenase vom Typ II die höchste Stoffwechselaktivität. Dies bezieht sich sowohl auf die Sauerstoffmessung als auch auf den Cell Proliferation Assay. Die Glucosaminoglykanproduktion lag signifikant über dem der anderen beiden Herstellungsansätze (p<0,005). 5. Im Stoffwechselaktivitätstest konnte bei einer Besiedlungsdichte von 500 000 Zellen/cm2 die effektivste metabolische Aktivität ermittelt werden. Hauptexperimente 1. Experiment: Vergleich zwischen 2-D und 3-D Kulturverfahren Das Gewebe der 2-D und 3-D Kulturen war ab dem 14. Kulturtag fest und mit einer Pinzette herausnehmbar. In der Mikroskopie konnte eine runde Zellmorphologie der Chondrozyten in der 2-D und in der 3-D Kultur über 4 Wochen belegt werden. Der Verlauf der Stoffwechselaktivität war in der 2-D Kultur gleich dem Verlauf der 3-D Kultur, doch die Höhe der metabolischen Aktivität lag in der 3-D Kultur unter der der 2-D Kultur (p<0,005). Die Glucosaminoglykansynthese lag in der 3-D Kultur signifikant über der der 2-D Kultur (p=0,002). Im Westernblot konnte für die 2-D und die 3-D Kultur kein Kollagen vom Typ I und III nachgewiesen werden, doch wurde Kollagen vom Typ II nachgewiesen. Mit der PCR war bis zum Tag 7 der Kultivierung eine Kollagen Typ I und II Produktion nachweisbar. Die Auswertung der histologischen Übersichtsfärbungen zeigten knorpelähnliches Gewebe und die Spezialfärbung eine beginnende Mineralisation der ECM. 2. Experiment: Einfaches 3-D Kulturverfahren Unter Verwendung der Injektions-Besiedlungstechnik gelangen keine erfolgreichen Besiedlungen. Bei der Sandwich-Besiedlungstechnik kam es zu zwei gelungenen Besiedlungen, die sich nicht reproduzieren ließen. In den Besiedlungen hatte sich das Gewebe makroskopisch verfestigt und histologisch konnte knorpelähnliches Gewebe nachgewiesen werden. Die Zellen waren über einen Zeitraum von 6,5 Wochen vital und zeigten mikroskopisch eine runde Zellmorphologie. In der Pentachromfärbung gab es Hinweise auf eine beginnende Mineralisation. 3. Experiment: Komplexes 3-D Kulturverfahren Nach dreiwöchiger Kultivierung der Chondrozyten auf der tubulären Matrix war makroskopisch eine ECM Synthese sichtbar, eine Verfestigung der Matrix hatte nicht stattgefunden. Die Zellen zeigten eine deutliche Vitalität im Lebend-Tod-Test. Im MTT-Test konnte die Stoffwechselaktivität der Zellen belegt werden, die mit der Glucosaminoglykanproduktion korrelierte. Im Westernblot war keine Kollagen Typ I und III Produktion nachweisbar. Eine Kollagen Typ II Produktion war nur in 2 Bioreaktoren vorhanden. Mit Hilfe der Ergebnisse aus den Vorversuchen wurde die Knorpelzellgewinnung optimiert, das Herstellungsverfahren zur flüssigen Matrix verbessert und die Versuchsbedingungen für weitere Experimente festgelegt. Mit der Entwicklung der neuartigen, flüssigen Matrix gelang die Etablierung einer 3-D Knorpelzellkultur, die mit den durchgeführten Nachweismethoden keinen Hinweis auf eine ausgeprägte Dedifferenzierung der Zellen ergab. In der zweiten Versuchsserie zur 3-D Kultivierung im einfachen 3-D Kultursystem konnten zwar Chondrozyten kultiviert werden, aber die Ergebnisse waren nicht reproduzierbar. Das letzte Experiment zum komplexen 3-D Kulturverfahren im Bioreaktorsystem belegte die Besiedelbarkeit größerer tubulärer Matrices. In allen drei Experimenten war die Stabilität der gezüchteten Knorpelgewebe noch nicht ausreichend, um eine flexible Luftröhrenprothese, wie z. B. die BioVam?, bei der Ex- und Inspiration zu stützen. Es ist noch viel Optimierungsarbeit im Bereich der Bioreaktortechnologie notwendig, um den Zellen eine ihrer physiologischen Umgebung angepasste Atmosphäre zu bieten und so, ein dem nativen Knorpel ähnliches Ersatzgewebe mit ausreichender mechanischer Belastbarkeit zu erhalten. Mit dieser Arbeit werden erste Schritte zur Entwicklung eines trachealen Organersatzes mit den Methoden des Tissue Engineering für die klinische Anwendung aufgezeigt.