Optimierung von Verfahren zum In-vitro-Gentransfer am Meerschweinchenherzen mittels adenoviraler Vektoren

Das Ziel dieser Studie war es, ein Verfahren zu etablieren, mit dem das intakte Herz eines Meerschweinchens unmittelbar nach der Organentnahme adenoviral infiziert werden kann. Dazu wurde das frisch entnommene Organ mittels einer Langendorff-Perfusion mit einer Lösung, die rekombinante Adenoviren enthielt, 30 min oder 60 min lang retrograd durchspült. Danach erfolgte die enzymatische Isolierung und Kultivierung der Herzmuskelzellen. In den folgenden sechs Tagen wurden (fluoreszenz-) mikroskopisch die Vitalität und Anheftungsfähigkeit der Kardiomyozyten in vitro sowie die Expression des Reportergens GFP kontrolliert. Durch die Zugabe von ITS zum Kulturmedium sowie die Beschichtung der Kulturschälchen mit Nitrocellulose konnten die Zellkulturbedingungen optimiert und die gewünschte Verbesserung der Anheftungsfähigkeit und Vitalität der Vorhofzellen erreicht werden. In den verschiedenen Versuchen wurde deutlich, dass die Virusexpositionsdauer sowie der Titer der adenovirushaltigen Perfusionslösung die resultierende Infektion beeinflussten. Je länger die Dauer der Virusperfusion und je größer das Virus-Zell-Verhältnis ist, desto größer ist die Zahl der Viren, die die Diffusionsbarrieren überwinden und die Herzmuskelzellen infizieren können. Mithilfe des adenoviralen Gentransfers wurde der purinerge A1-Rezeptor in den Kardiomyozyten überexprimiert und die Auswirkungen auf den Strom IK(ACh) (GIRK) mittels der Patch-Clamp-Technik untersucht. Die infizierten Myozyten zeigten nach der Applikation von Adenosin eine im Vergleich zur nativen Kontrollgruppe schnellere Aktivierungskinetik und größere Amplitude des Kaliumstromes, die sogar die Amplitude des durch Acetylcholin induzierten Stromes überstieg (die parasympathische Stimulierung hat einen negativ chronotropen Effekt; der physiologische Signalweg führt zur Aktivierung von muskarinergen M2-Rezeptoren, zur Aktivierung von Gi G-Proteinen und nach Bindung der beta gamma-Untereinheit an die GIRK-Untereinheit zum Öffnen der K+-Kanäle). Dies könnte das Resultat einer Konkurrenz von A1- und M2-Rezeptoren um einen gemeinsamen Pool von G-Proteinen oder negativer Auswirkungen der Überexpression des A1-Rezeptors auf die Expression des M2-Rezeptors sein.   Letztendlich konnte ein Verfahren etabliert werden, mit dem ein intaktes Meerschweinchenherz unmittelbar nach der Organentnahme adenoviral infiziert werden kann. Darüber hinaus bietet das beschriebene Verfahren gegenüber der Infektion in der Zellkultur den Vorteil, dass das Reportergen, im Hinblick auf die Dauer der Primärkultivierung, etwa ein bis zwei Tage früher in einer für weiterführende Untersuchungen ausreichenden Menge exprimiert wird.