Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Optimierung von Verfahren zum In-vitro-Gentransfer am Meerschweinchenherzen mittels adenoviraler Vektoren

Nave, Andrea

The objective of this study was to establish a method in which the intact heart of a guinea pig could be adenovirally infected immediately after organ-extraction. To infect cardiomyocytes, the recombinant adenoviruses were added to the solution that perfused the isolated heart mounted in a Langendorff-perfusion system. Following a 30 min or 60 min retrograd heart perfusion, atrial myocytes were isolated enzymatically and cultured for a period of 6 days. During the cultivation time, the adhesion of the cardiomyocytes and their vitality were controlled optically. The expression of the reporter gene was investigated by counting GFP-positive cells. Adding ITS to the culture medium and coating the cell culture dishes with nitrocellulose improved adhesion and vitality of the atrial myocytes. It is shown that the cell infection rate depend on the duration of virus exposure and the titer of the adenovirus. The number of infected cells increased with an increasing  virus perfusion time. In addition, increasing the ratio virus titer /atrial cells improved cardiac myocyte infection.  The purinergic A1-receptor was overexpressed in rat atrial cardiomyocytes via adenoviral gene transfer. Since activation of the A1-receptors results in the activation of an inward rectifying K+ current (GIRK current), a successful cell infection can be investigated by measuring activation kinetics and amplitude of the adenosine-induced GIRK current. Upon adenoviral-induced A1-receptor overexpression, GIRK current exhibited faster activation kinetics and an increase in the current amplitude compared to control cells. The amplitude of the adenosine-induced GIRK current even exceeded the amplitude of the acetylcholine-induced current (the physiological pathway of the negative chronotropic effect upon parasympathetic stimulation involves activation of muscarinic M2-receptors, activation of Gi G proteins and opening of the K+ channel after binding of beta gamma subunits to the GIRK subunits). The negative interference of  M2- and A1-receptors might involve competition about a common pool of G proteins or an A1-induced negative effect on the M2-receptor expression level.    Finally, a method was established to infect an intact guinea pig heart immediately after extraction with adenoviruses. Furthermore, compared to the time course of GFP expression in cultured cardiomyocytes, the method, described in the present study, offers the advantage of an immediate GFP expression after plating the cells. This allows electrophysiological or biochemical experiments within 2 days after cell isolation compared to 4-5 days with a conventional infection method.

Das Ziel dieser Studie war es, ein Verfahren zu etablieren, mit dem das intakte Herz eines Meerschweinchens unmittelbar nach der Organentnahme adenoviral infiziert werden kann. Dazu wurde das frisch entnommene Organ mittels einer Langendorff-Perfusion mit einer Lösung, die rekombinante Adenoviren enthielt, 30 min oder 60 min lang retrograd durchspült. Danach erfolgte die enzymatische Isolierung und Kultivierung der Herzmuskelzellen. In den folgenden sechs Tagen wurden (fluoreszenz-) mikroskopisch die Vitalität und Anheftungsfähigkeit der Kardiomyozyten in vitro sowie die Expression des Reportergens GFP kontrolliert. Durch die Zugabe von ITS zum Kulturmedium sowie die Beschichtung der Kulturschälchen mit Nitrocellulose konnten die Zellkulturbedingungen optimiert und die gewünschte Verbesserung der Anheftungsfähigkeit und Vitalität der Vorhofzellen erreicht werden. In den verschiedenen Versuchen wurde deutlich, dass die Virusexpositionsdauer sowie der Titer der adenovirushaltigen Perfusionslösung die resultierende Infektion beeinflussten. Je länger die Dauer der Virusperfusion und je größer das Virus-Zell-Verhältnis ist, desto größer ist die Zahl der Viren, die die Diffusionsbarrieren überwinden und die Herzmuskelzellen infizieren können. Mithilfe des adenoviralen Gentransfers wurde der purinerge A1-Rezeptor in den Kardiomyozyten überexprimiert und die Auswirkungen auf den Strom IK(ACh) (GIRK) mittels der Patch-Clamp-Technik untersucht. Die infizierten Myozyten zeigten nach der Applikation von Adenosin eine im Vergleich zur nativen Kontrollgruppe schnellere Aktivierungskinetik und größere Amplitude des Kaliumstromes, die sogar die Amplitude des durch Acetylcholin induzierten Stromes überstieg (die parasympathische Stimulierung hat einen negativ chronotropen Effekt; der physiologische Signalweg führt zur Aktivierung von muskarinergen M2-Rezeptoren, zur Aktivierung von Gi G-Proteinen und nach Bindung der beta gamma-Untereinheit an die GIRK-Untereinheit zum Öffnen der K+-Kanäle). Dies könnte das Resultat einer Konkurrenz von A1- und M2-Rezeptoren um einen gemeinsamen Pool von G-Proteinen oder negativer Auswirkungen der Überexpression des A1-Rezeptors auf die Expression des M2-Rezeptors sein.   Letztendlich konnte ein Verfahren etabliert werden, mit dem ein intaktes Meerschweinchenherz unmittelbar nach der Organentnahme adenoviral infiziert werden kann. Darüber hinaus bietet das beschriebene Verfahren gegenüber der Infektion in der Zellkultur den Vorteil, dass das Reportergen, im Hinblick auf die Dauer der Primärkultivierung, etwa ein bis zwei Tage früher in einer für weiterführende Untersuchungen ausreichenden Menge exprimiert wird.

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Nave, Andrea: Optimierung von Verfahren zum In-vitro-Gentransfer am Meerschweinchenherzen mittels adenoviraler Vektoren. Hannover 2005. Tierärztliche Hochschule.

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